蠶卵保存及人工孵化
余錫金
行政院農業委員會苗栗區農業改良場

摘　要
       家蠶發源於中國黃河流域，已超過5000年歷史。蠶種經由絲路陸續傳播到世界各地，為適應各地不同生態環境、突變及經人為選汰而產生許多具有地區特色的品種(系)。從氣候分佈形態看，較高緯度的溫帶地區，因低溫桑樹休眠期長，桑葉生產期短，所以發展出一年只能完成一世代的一化性家蠶，這類家蠶大部份時間以休眠卵的形態渡過漫長低溫期；中緯度地區，四季分明，桑樹休眠期較短，從晚春到秋季都有桑葉產出，因此發展為一年可完成二個世代的二化性家蠶，惟冬季及早春仍以休眠卵的形態渡過；低緯度的熱帶地區，桑樹無明顯的休眠期，幾乎全年都有桑葉產出，因此發展為不休眠，一年可完成三世代以上的多化性家蠶。本文從蠶卵休眠特性、胚胎發育過程中卵內碳水化合物及其相關酶類活性變化，說明如何運用溫度調控，在特定期間內保持蠶卵品質；及應用溫度等環境調節，配合鹽酸浸漬處理，於需要養蠶的時候，促使蠶卵適時整齊孵化的方法。

關鍵詞：家蠶，卵，休眠，碳水化合物，酶，保存，人工孵化。

前　言
       蠶業發源於中國黃河流域，至今已有數千年歷史。家蠶(Bombyx mori L.)經由絲路，逐漸散布到世界許多地區，並在不同之生態環境中，形成許多地理小種(蒲生，1981；小林等，1986a)。家蠶為典型以卵休眠越冬昆蟲之一(吉武，1965；韓等，2009；Yamashita et al., 1981)。從氣候分布型態觀之，低緯度地區，高溫多溼，桑樹終年常綠，週年皆可養蠶，故演化產生不休眠之多化性品系；中緯度地區，氣候適中，多屬二化性家蠶品系；而較高緯度之溫帶，桑樹休眠期長，自然氣溫甚低，不適於家蠶生活，因此全年僅能完成一世代，長時間係以休眠狀態之卵，渡過寒冬(小林等，1986a)。
台灣地處熱帶與亞熱帶，氣候適宜，農家以飼養具有休眠性家蠶品種為主。民國60年以前，每年多僅在春秋二季各養蠶一次；自民國61年，政府推行加速農村建設計畫，鼓勵企業化栽桑養蠶以後，飼蠶次數即逐漸增加為每年6~8次(謝，1986)。但具休眠性品種之蠶卵，在自然狀況下，需經一段低溫時期始能孵化；且休眠卵一旦活化以後，在一定時間內，必需孵化飼養，否則即逐漸虛弱死亡(高見，1969a)。因此，如何妥善處理蠶卵適時孵化，以配合養蠶時機，乃為蠶業經營成敗關鍵要素之一。至目前為止，解決方法係以不同人工越夏時間，配合冷藏、浸酸等人工孵化處理(高見，1969b；沓掛，1971b)。然而，休眠卵因品系及產卵前後環境條件不同，其所適應之低溫處理時間亦不同(高見，1970；沓掛，1971a；黑岩，1979；余等，1990、1991b)。本文將從不同家蠶品系胚胎發育過程中卵內主要碳水化合物變化與蠶卵人工越夏、低溫冷藏之關係，配合鹽酸孵化處理，提供蠶卵保存及孵化處理之參考。

蠶卵保存
一、 蠶卵休眠及低溫保存原理
       蠶卵是否具有休眠性，主要係受遺傳性狀決定，但其親代所處環境的影響亦很大。一化及多化性家蠶，環境變異對其休眠性之影響較小，二化性者則甚敏感，其中以蠶卵胚胎發育期間，受溫度變異之影響最大(吉武，1965；諸星，1979；黃，2003)。二化性蠶卵以24℃以上之溫度催青(即孵卵，incubation)，其次代蠶卵全部休眠；低於17℃催青者，全部不休眠；以20℃催青，每日照明16小時以上，次代卵多數休眠；照明16小時以下，幼蟲1~3齡在高溫長日照下，4~5齡在低溫短日照下，較具休眠性，反之則導致反效果(諸星，1979)。又據小林等(1986a)調查，稚蠶期在25℃~28℃範圍內，溫度高者，其次代蠶卵之休眠率亦高，壯蠶期在25℃~20℃內，其次代蠶之休眠卵率隨溫度之降低而提高，整個幼蟲期對溫度感應之轉捩點在四齡起蠶時期。山本等(1982)亦認為四齡幼蟲至化蛹期間，低溫(21℃)有加強多化性家蠶次代卵休眠之作用。
       二化性家蠶稚蠶期光照時間長，壯蠶期光照時間短者其後代蠶卵休眠性較高，反之休眠性降低(諸星，1979)。但多化性者則呈長日型週光期反應，且其轉捩點在三龄蠶時期(小林等，1986b)。催青期間，乾燥之環境比高濕者容易造成次代蠶卵不休眠(水野，1925)。以幼嫩或污染之桑葉飼蠶，易使其次代蠶卵不休眠(有賀，1949)。在日本之生態環境下，初秋飼育之多化性家蠶比春季者之休眠率高，冬季飼育者又更高；故山本等(1982)認為，除溫濕度外，桑葉品質及光照等其他環境條件之相互作用，對家蠶之休眠性亦有影響。
人工飼料飼育之家蠶，其後代蠶卵之休眠性比以桑葉飼育者更易受環境變異之影響(高宮，1976；木下等，1982)。以桑葉飼育者，蠶卵之休眠性主要是受其親代卵之胚胎發育期間催青溫度所影響，幼蟲期光照條件影響較小，已如前述。但以人工飼料飼育時，幼蟲期之光週期條件卻反而比催青期之環境更重要，不論催青期環境條件如何，幼蟲期光照時間越短者，其次代蠶卵之休眠率越高(高宮，1976)。惟幼蟲期光照條件對次代蠶卵休眠性之影響程度亦因品系而異，且中國系統之品系比日本系統者易受飼料及光照條件影響(木下等，1982)。
家蠶受精卵約經過2-3小時，開始第一次核分裂。產卵後約8小時，胚胎進入胚盤(blastoderm)發生期(大槻，1978；坂口，1981)。胚盤形成後，卵腹區範之細胞，逐漸密集增厚，形成胚帶(germ band)。胚帶初期之形狀近似正方形，此後漸變長，並在前端附近，左右內陷，分化成頭葉；隨之，胚體沿正中內陷，形成縱走之原溝(primitive groove)。內陷部分產生兩層細胞，外層細胞即外胚層(ectoderm)，內層則為中胚層(mesoderm)。中胚層細胞最初沿外胚層均勻分裂，成為細長之薄層，然後再變為厚薄相間之層次，使胚胎外觀呈現分節現象。胚胎發生至此階段，休眠卵與不休眠卵間並無明顯差異(水野，1925；柳田，1928；高見，1969c；大槻，1978)。休眠卵之胚胎，在25℃下，產卵後約40小時，在胚體之18節可識別時，開始進入休眠期。蠶卵休眠期間，胚胎之外部形態幾乎不變，但卵內之肝糖(glycogen)在休眠開始後，急速轉化為甜醇(己六醇，sorbitol)及甘油(丙三醇，glycerol)(柳沼及山下，1977；岡崎及山下，1981；山下，1982；古沢及四方，1982；Yaginuma and Yamashita, 1978; Yamashita et al., 1981; Furusawa et al., 1982)。
       許多昆蟲以多元醇(polyols)為抗凍劑(Steel, 1982 )。故家蠶之休眠卵比不休眠卵者含有較高濃度之甜醇及甘油，以保護其在越冬休眠期間免受凍傷(Yaginuma and Yamashita, 1978)。因此，吾人得以利用這個機制將蠶卵作較長期間的保存。休眠卵之胚胎處於何種生理狀態方能孵化或繼續貯存，以及如何處理使其配合養蠶時機適時孵出，一直為蠶種研究者之探討課題。據水野(1925)報告，前人乃按胚胎之外部形態，藉以判定其是否已渡過休眠期；但如此很難完全掌握胚胎之真正生理狀況(水野，1925；北沢等，1963；高見，1970 )。為了解其是否真正終止休眠，需將部分卵置於17.5℃之環境下，逐日觀察其變化(水野，1925)；或調查細胞是否已恢復分裂(北沢等，1963)；及在適溫下，觀察胚胎發育是否順調(高見，1970)以為輔助。自從1957~1958年，Chino相繼發表有關休眠卵內碳水化合物相互轉化之假說(見柳沼及山下，1977；古沢及四方，1982；Suzuki and Miya, 1977; Furuawa et al., 1982)後，研究人員即致力於相關之探討。目前已確定，蠶卵開始休眠時，卵內之肝糖急速轉化為甜醇；休眠覺醒時，甜醇又轉化為肝糖，以便提供胚胎發育所需能量。甘油在蠶卵進入休眠後，陸續由肝糖及脂質轉化與累積；休眠結束後，甘油亦轉化為肝糖；但其轉化過程與休眠之開始及結束時期並不一致(柳沼及山下，1977；山下，1982；黃，2003；Yamashita et al., 1981 )。
       肝糖含量佔卵巢中碳水化合物之90%以上(山下，1982)。而休眠卵之肝糖含量較不休眠卵高出甚多(山下，1965；山下，1982；古沢及梁，1987)。又卵內肝糖蓄積量之多寡，受其雌親之休眠激素(diapauses hormone, DH)所控制(山下，1982；Yamashita and Hasegawa, 1976; Yamashita et al., 1981)。DH之功能在於激發卵巢中花粉糖酶(trehalase)之活性，使血液中之花粉糖(trehalose)轉化為肝糖，蓄積於卵巢再轉移至卵；此項功能具有專一性(山下，1965；Yamashita and Hasegawa, 1976; Shimada and Yamashita, 1979; Miyadai and Yamashita, 1980)。
休眠開始後，胚胎外部形態已無明顯變化，但由於肝糖磷酸轉化酶(phosphorylase)之催化，卵內之肝糖急速轉化為甜醇(岡崎及山下，1981；山下，1982；Yamashita et al., 1981; Steel, 1982)。當休眠初醒，甜醇又轉化為肝糖時，NAD-dependent sorbitol dehydrogenase 為其關鍵酶(山下，1982；Yaginuma and Yamashita, 1979; Yamashita et al., 1981)。此種酶在低於5℃之溫度中，其活性可能會受到抑制(Furusawa et al., 1982)。

二、 應用蠶卵休眠特性於蠶卵保存
       休眠卵產下後27~28小時，槳液膜(serosa)開始著色，約一週後，卵大致呈固有色，約一個月後，休眠卵始完全進入休眠(高見，1969c；大槻，1978；黑岩，1979)。蠶卵一旦進入休眠，即必須接觸一定時間之低溫，否則不能獲得正常之孵化機能(高見，1970)。一般休眠卵進行低溫處理以前，需依預定貯藏時間，先經一段夏期(高溫)保護；這段高溫保期間，以25℃處理者比20℃或30℃處理者可獲得更長的冷藏期限(沓掛，1971a)。越夏期間，以25℃處理頗為重要；如長期接觸22℃以下之低溫，蠶卵易軟性化而縮短其有效冷藏期限(黑岩，1979)。25℃之越夏處理日數在90日以內者，處理時間越長，欲獲得孵化機能所需低溫處理日數亦越長(高見，1970)。根據國內外的研究，二化性之休眠卵產下後，以25℃保護50小時移入5℃冷藏，約在20-27日間完成休眠期，40~52日完成越冬期(甲斐等，1995)；台灣之蠶種，不論中國或日本系統，休眠卵產下後，以25℃保護5~60日移入5℃冷藏者，其胚胎完成休眠、越冬到達臨界期所需冷藏日數詳如表1。
由表中數據可知，不同品系及25℃保護日數之蠶卵，到達各胚胎期所需冷藏日數均不同；越夏期間長者，需冷藏日數亦較長；且相同越夏條件下，日本系統之卵較中國系統者，又需更長的冷藏期間(余等，1990)。測試休眠卵內碳水化合物含量結果，休眠開始後，多數日本系統休眠卵之多元醇含量亦普遍較中國系統者高，顯示在相同環境條件下，日本系統家蠶品系蠶卵之休眠度較中國系統者強(余等，1991a)；因此，解除休眠需較長的冷藏期間，也意味著蠶卵可以獲得較長的保存期限？但事實並非一定如此，著者同時測定中系×日系的雜交卵時，發現除產下3小時以內，尚未或剛完成受精之卵，其多元醇與肝醣含量與其雜交母本相同外，隨卵齡增加，即逐漸呈現差異，並且當卵冷藏至胚胎臨界Ⅱ期以後，雜交親本之卵死亡率已顯著增加時，雜交卵却仍維持甚高之孵化率。因此，推論蠶卵休眠性主要受其前世代雌親所控制，但受精以後，胚胎發育期間，亦受其雄親所攜帶遺傳信息相當程度之影響(余等，1991a)。檢視高見(1970)之報告，發現雜交卵與其親本之卵，在冷藏浸酸等孵化處理上亦有差異；吳等(1994)調查低於5℃中保存的蠶卵，亦得到雜交蠶卵的耐冷藏能力明顯比其雜交親本者強的結果。
表1. 不同越夏日數之休眠蠶卵各胚胎發育期所需5℃越冬冷藏日數
Table.1. Durations required for chilling at 5℃ in each embryonic stage of diapauses eggs for different oversummering days at 25℃

       休眠卵活性化最有效的越冬冷藏溫度是5~7.5℃。蠶卵一旦脫離休眠，若不欲及時令其孵化，則必需以較低之溫度冷藏，抑制其體能過度消耗。但0℃以下之溫度，不利於尚未完全活化之卵繼續活化。此時，用2.5℃之溫度，可兼收蠶卵貯存及補活性化不足之效(高見，1970；沓掛，1971b)；若蠶卵尚未脫離休眠期，可用5℃冷藏結合鹽酸處理解除休眠(朱等，1993)。為能有效延長蠶卵保存期限，可將蠶卵產下後在25℃越夏保存60日→室內自然溫度中180日，期間以15℃處理1~6次，至胚胎發育達臨界期→2.5℃抑制胚胎繼續發育，嘗試品種保存的卵每3年更新2次，或2年更新1次之可行性(清水及荒川1977)；產卵後25℃，90日→每隔數日降低5℃，至5℃時保存5日→2.5℃，25日→0℃，50日→-2.5℃150日(松野及清水，1978)；產卵後25℃，2日→5℃，60日→0℃，120日→-2.5℃，120日，中間溫度處理→2.5℃，90日(笹原等，1979)；產卵後25℃，30日→0℃，150日~460日→浸酸→5℃，40~110日(朱等，1993)及產卵後25℃，30日→1℃，300~400日→5℃，80~100日(吳等，1994)等。以上蠶卵長期保存期間，須注意防止蠶卵失水過多及不同品種對低溫忍受性之差異，以免死卵增加，及保存品種之基因流失，減少遺傳變異。

三、 多化性蠶卵保存
       多化性蠶卵不具休眠性，在25℃中，卵產下10日即孵化。因此類家蠶卵內之肝醣只有少量能轉化為多元醇(古澤及梁，1987)，故不耐低溫保存。台灣往昔慣行方法係將產下24~48小時的卵，置於5℃中抑制胚胎發育，大約能保存30日，因此每年需更新7~8次(謝等，1986)。根據沈及胡(1988)報告，中國大陸的多化性不休眠卵產下後，以25℃保護26小時，移入5℃冷藏60日後，仍有81%之孵化率，但至90日則降至約5%。筆者等人進一步研究，發現卵產下後，以25℃保護30小時移入5℃中冷藏，較更長或更短之25℃保護時間，及其他更高或更低的冷藏溫度，可獲更長之保存期限，在供試的4個品系中，有3個品系之卵，冷藏90日仍可達到80%以上之孵化率；經調查胚胎發育結果，25℃保護30小時的卵，其胚胎正處於尾節分化期(余等，1993)；此一結果對照古澤及梁(1987)指稱之「在5℃中多化性蠶於胚胎發育至尾節分化期時，其多元醇含量達到最高」，此時期之卵最耐冷藏自屬合理。依據上述方法，多化性蠶卵的保存每年雖可減少一半以上之繼代養蠶次數，惟與休眠性蠶卵比較，仍相對的需增加許多人力物力。
根據小林等(1986a)報告，稚蠶期在25~28℃範圍內，溫度較高者其次代蠶卵之休眠率亦較高，而壯蠶期在25~20℃範圍內，則隨溫度之降低而提高休眠卵率；山本等(1982)亦指出，四齡幼蟲至化蛹期間，低溫(21℃)有加強多化性蠶次代卵之休眠作用；及二化性家蠶稚蠶期光照時間長，壯蠶期光照時間短者，其次代卵之休眠性較強，反之則休眠性降低(諸星，1979)，但多化性家蠶則與此相反，且其轉捩點在三齡起蠶時期(小林等，1986b)。因此欲延長多化性蠶卵之保存期限，除需特別注意產卵後25℃之保護時間及冷藏溫度外，如能再探討其親代幼蟲及蛹期等之生態環境，或許可獲得更長的蠶卵保存時間。

蠶卵人工孵化
       為使蠶卵在預定時間整齊孵化，須進行人工孵化作業。不休眠卵及休眠卵胚胎已發育至臨界期以後者，只須於設定的溫濕度光照空氣調控良好的環境中催青，即可使蠶卵孵化整齊。胚胎尚未進入休眠期的休眠性蠶卵，亦可利用人工孵化處理，阻止蠶卵休眠，然後比照不休眠卵方式進行催青。開始進入休眠期以後的蠶卵，則須俟胚胎發育完成休眠、越冬期，或以適當的人工孵化處理才能使蠶卵孵化整齊。
促使休眠中的蠶卵孵化的方法有物理或化學性刺激等10多種，惟目前普遍採用鹽酸浸漬法(高見，1970；沓掛，1971a；戶谷，1977)。因此，以下人工孵化所提到的浸酸皆是指浸漬鹽酸。浸酸處理的標靶及其作用機制尚未完全明瞭，目前所知，是與一種家蠶卵內的蛋白質脂酶(esterase4，EA4)的ATPase活性變化有關。EA4是家蠶休眠卵內的生物鐘蛋白酶(time interval measuring enzyme)，在不休眠卵內始終具有活性，但在尚未完成休眠期的卵內，因與一種胜肽抑制因子(peptide inhibitory needle, PIN)緊密結合，而呈不活性，只有在休眠卵感受到足夠讓蠶卵解除休眠的低溫時間或浸酸等刺激，才能獲得瞬時活性，爾後又恢復不活性狀態(徐等，2000；徐等，2001；王等，2007；甲斐，2008)。蠶卵是否已解除休眠、完成越冬，需不需要浸酸等人工孵化處理，可經由胚胎形態觀察，配合卵內肝醣，甜醇消長或EA4活性調查做較精確的判斷；惟鹽酸濃度、溫度、浸酸時間仍須視品種(系)及蠶卵冷藏保存狀況而調整，謹簡單歸納說明如下。

一、 即時浸酸孵化法
       此種方法應用於休眠性蠶卵產下後，胚胎發育尚未進入休眠期前，用浸酸處理，阻止蠶卵進入休眠，可於蠶卵下後11~30日間，配合產業需求，適時孵化。本法又可分為加溫與常溫浸酸二種。加溫即時浸酸須把握產卵後在24~25℃中，卵齡20~25 hr，胚胎呈不到翁狀時，用46℃，15%之HCl，中國系統母本或蠶卵較小者，浸4~5 min，日本系統母本或蠶卵較大者，浸5~6 min，浸漬溫度須較精準，否則易造成刺激過度或不足。常溫即時浸酸的適用卵齡範圍較寬，產卵後在24~25℃中10~25 hr之卵皆可，鹽酸濃度22%，液溫在24~28℃間，浸漬時間60~70 min前後均可獲得90%以上之實用孵化率。

二、 冷藏浸酸孵化法
       此種方法應用於休眠性蠶卵一旦進入休眠期，經過一段低溫冷藏，胚胎已完成休眠期，進入越冬期，但尚未到達臨界期蠶卵之孵化處理(余等，1991)。如果胚胎尚未完成休眠期，照一般常規浸酸也不可能在11~14日間孵化，因此不能實用；但胚胎如果到達臨界期的後期，浸酸則會造成孵化之幼蠶虛弱，甚至死亡。以上所述之胚胎發育期會因蠶品種、蠶卵產下後在25℃中保護的時間長短及5℃冷藏日數而異。產卵後25℃保護約40 hr，5℃冷藏25~30日之卵，可用47.8℃，20%鹽酸，浸酸時間中國系統者6~7 min，日、歐系統者7~8 min；產卵後25℃保護42~50 hr之卵，冷藏日數需達40~60日，再輔助以20%鹽酸，液溫47.8℃，中國系統者浸漬5~6 min，日、歐系統者浸漬6~7 min，孵化效果較佳。產卵後在25℃保護5~30日始移入5℃冷藏者，其25℃保護時間長者，所需5℃冷藏日數亦長，已詳如表1；這類蠶卵5℃冷藏日數均需達50以上，再視胚胎發育狀況，輔以48℃，20%鹽酸處理，始可獲得較佳之實用孵化率。剛脫離休眠期進入越冬期的卵，浸酸可顯著促進孵化整齊，且在3~7 min內，浸酸時間越長者，效果越好；胚胎發育已達越冬中、後期之卵，浸酸亦可促進孵化整齊，一般中國系統者浸漬4~6 min，日本系統者浸漬5~7 min，可獲較佳實用孵化率；當胚胎到達越冬後期，部份已進入臨界期時，浸酸亦可促進孵化整齊，惟浸漬時間在3~7 min內之實用孵化率無顯著差異；胚胎達臨界期之卵，浸酸與否，對孵化率已無影響，不必浸酸亦可獲得良好之孵化率；當胚胎進入臨界期之後期，胚体已充分伸長，且少數呈現器官形成初期之特徵時，若再進行浸酸處理，孵化率即呈現反效果，浸酸時間越長者，效果越差(余等，1991)。蠶卵冷藏浸酸處理後，如遇特殊情形，不準備催青孵化時，只要於浸酸後25℃，48 hr內，胚胎發育至器官形成初期以前，移入5℃或2.5℃冷藏，50日內再移出催青，均仍可獲得良好之實用孵化率，若再冷藏期間需超過50日，則以2.5℃為佳，惟時間仍不宜太長(黑岩及二瓶，1979)。

三、 短期冷藏或未冷藏家蠶休眠卵的隨時孵化
       若能妥善運用前述之蠶卵人工孵化及保存技術，事先擬定蠶卵使用計畫，業者大致可在所期望的時機，獲得孵化良好的蟻蠶。惟若遇臨時狀況，在休眠卵尚未冷藏或冷藏時間少於25日，按照前述方法均不能適用時，可嘗試下列方法應急。
(1) 產卵後24℃保護40~50 hr的卵，5℃冷藏25日以內者，可於出庫直後，在35~40℃高溫中放置120~180 min，再用22%，48℃鹽酸浸酸7 min(西村，1977)。
(2) 產卵後在25℃，75~80%RH中保護1~7日，尚未完全休眠的卵，可用1.075 kg/L HCl，於46℃浸酸5~70 min。產卵後在25℃中保護達15日，且未經低溫冷藏者，可直接用38~39℃衝擊1 hr，再於47.8℃，1.092 kg/L HCl中浸酸25 min；若已在5℃中冷藏20~30日者，則出庫後直接用38~39℃衝擊1 hr，再以上述HCl濃度及溫度浸酸13~15 min。以上處理据稱均可獲得約90%之實用孵化率(邵等，2004)。

結 語
       從台灣省蠶業改良場、蠶蜂業改良場到農委會苗栗區農業良場，個人在這個場服務41年。屆臨退休時刻，感謝侯場長邀請，參與這個研討會，將這些年來的部份研究成果、工作經驗及讀書心得向各位報告。家蠶是被研究得最透徹，應用最多的昆蟲之一。鑑於目前國內各院校已鮮少相關課程及研究，致有意以家蠶做為研究或應用題材者，在蠶卵保存及孵化處理時，常感困惑無助，特藉此機會提出本議題和大家共同研討。目前為止，這個領域仍有一些在學理上還不能圓滿解釋及技術上仍不能克服之處，期盼有興趣的年輕同仁，專心於產業應用研究之餘，能撥出些許時間，關注這些最基本、吃力不討好却必須有人去做的事，俾能繼往開來，讓家蠶不論在學術研究或產業應用都能與時俱進，續創佳績。