瓜類病毒病害經種子傳播的特性及其檢測方法

摘要

      台灣瓜類種類多且栽培面積大，病毒病害嚴重，目前本國瓜類作物上發生的病毒被確認的至少有八種，包括瓜類蚜媒黃化病毒(CABYV)、胡瓜綠斑嵌紋病毒(CGMMV)、胡瓜嵌紋病毒(CMV)、甜瓜脈綠嵌紋病毒(MVbMV)、木瓜輪點病毒-西瓜系統(PRSV-W)、番茄班點萎凋病毒(TSWV)、西瓜銀斑紋病毒(WSMoV)、及矮南瓜黃化嵌紋病毒(ZYMV)，各種病毒感染或複合感染，造成植株不同程度的病徵，不但影響品質也影響產量。

      其中CGMMV及ZYMV有經種傳播的能力，此外，北美報告的南瓜嵌紋病毒(SqMV)，歐洲及日本發生的甜瓜壞班點病毒(MNSV)，非洲出現的甜瓜皺葉嵌紋病毒(MRMV)都可經種傳播至瓜類幼苗。CGMMV、MNSV、及ZYMV的種媒現象都是病毒污到種子外部種皮，因為病毒無法在成熟的種皮上繁殖，所以不易由種子上直接檢測出病毒，且以乾熱處理，即可去除病毒。

      SqMV及MRMV病毒入侵至種胚，可直接檢測出種皮、胚乳層、與胚的病毒，乾熱或藥劑處理，無法降低病毒種媒傳播率。MNSV、MRMV、SqMV、及ZYMV都被國內檢疫單位列為適用「有條件輪入植物或植物產品之檢疫條件」的有害生物，進口瓜類種子應避免這類病害的發生，或需經適當之檢疫處理。而CGMMV的發生僅限於歐洲與亞洲，因此其檢疫問題被其他非疫區或家所關切。上述五種病毒的診斷鑑定技術已有：接種判別寄主試驗、電子顯微鏡檢查、血清或核酸鑑定等，但如果同時間內需完成大量標本的病毒檢測時，目前仍以酵素免疫分析(ELISA)最為實用。

      針對種媒病毒的特性，瓜類種子健康檢查時病毒檢測的標準程序擬訂如下：1.取樣方式完全遵循國際種子檢查規則的取樣程序，且目標若為CGMMV的檢查其供樣品數不能少於800，若為SqMV則樣品數為500-2000。2.檢測方式採出芽試驗結合ELISA，檢測實際經種傳來的病害發生量。3.結果依國際種子檢查規則，以受感染數的百分比表示。至於病毒檢出的容許率，則有待訂定，但以檢疫觀點，MNSV、MRMV、SqMV、及ZYMV，其檢出率應絕對是零。

前言

      台灣氣候適合瓜類栽植，因此栽培面積廣大且種類繁多，根據2003年行政院農業委員會農業統計年報，葫蘆科作物中越瓜、胡瓜、冬瓜、苦瓜、西瓜、香瓜、及洋香瓜等的生產面積共約為30453公頃(表一)，此外尚有南瓜、絲瓜、稜角絲瓜、扁蒲等作物被廣泛栽培，及少數蛇瓜或梨瓜等零星栽培。由於瓜類作物週年種植的結果，造成其中各種病蟲害的發生與蔓延不止，尤以病毒病害最嚴重，為此類作物生產的限制因子(黃和葉，1995)。

      目前本國瓜類作物上發生的病毒被確認的至少有八種(吳等，1995;許等，1987;Deng,et al.,1993a;Yeh et al.,1988;Yeh et al.,1992)，這些病毒在不同瓜類作物的為害情形各有差異(張等,1987;黃等,1987;Huang et al.1993b)，植株上病毒單獨感染，造成植株不同程度的病徵，罹病較輕的植株出現輕微的斑駁嵌紋，使植株生育不良，嚴重者葉片及果實畸型或頂芽壞疽造成植株矮化及生長停止甚造成植株死亡，不但影響品質也影響產量，且所有瓜果一旦罹患病毒病即無藥劑可以治癒。唯有防患於未然或早期發現早期防治，病害管理才能收效，但田間病害發生時，經種子媒介，植株幼苗由上一代帶的病毒感染而發病，即成為「初感染源」(primary inoculums)扮演啟動整個病害流行的角色，且經種子攜帶，病毒可存活長久，傳播的範圍更是無遠弗界。因此具有經種子傳播能力的病毒在病害生能上有其特殊性，而種子帶毒的檢測與防除技術之重要性已不言可喻。

瓜類病毒種類與種媒特性

      在台灣瓜類上發生且已鑑定的病毒種類如表二所示，包括瓜類蚜媒黃化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus, CABYV) ( Deng, et al., 1997)、捐瓜綠斑嵌紋病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)(王和陳，1985)、胡瓜嵌紋病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)(許等,1987)、甜瓜脈綠嵌紋病毒(Melon vein-banding mosaic virus, MVbMV) (Huang, et al.,1993a)、木瓜輪點病毒-西瓜系統(Watermelon type of Papaya ringspot virus, PRSV W) (Huang and Chang, 1989)、番茄斑點萎凋病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV) (Yeh et al., 1988)、西瓜銀斑紋病毒(Watermelon silver mottle virus, WSMoV) (Yeh et al., 1992)、及矮南瓜黃化嵌紋病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)(許等，1985)共有八種。

      在台灣西瓜、胡瓜、絲瓜、苦瓜、冬瓜、南瓜均以ZYMV發生最普遍且惑染比率最高，PRSV-W次之，CMV佔少數，PRSV-W次之，CGMMV則最少。甜瓜也以ZYMV感染比例最高，但以CMV次之，PRS-W及CGMMV則佔少數。在扁蒲上以CGMMV佔最多，ZYMV、PRV-W及CMV則佔少數。其中CABYV僅由桃蚜或棉蚜傳播感染，CGMMV可藉由種子及汁液機械傳播，CMV、MVbMV、PRV-W、及ZYMV均可經蚜蟲媒介或汁液傳械傳播，TSMV及WSMoV則是主要靠薊馬傳染。除此之外，國外尚有報導甜瓜壞疽斑點病毒(Melon necrotic spot virus, MNSV)、甜瓜皺葉嵌紋病慣(Melon rugose mosaic virus, MRMV)、南瓜嵌紋病毒(Squash mosaic virus, SqMV)、及部份ZYMV可經種子傳播至瓜類幼苗。分述如下：

一、胡瓜綠斑嵌紋病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)

      CGMMV屬於煙草嵌紋病毒屬(Tobamovirus)，病毒呈直桿狀，大小約300X18nm，具單股核糖核酸(+)ssRNA。主要感染葫蘆科作物，在胡瓜上引起葉片斑駁、隆起、皺縮變形及植株矮化等病徵，部份系統在果實上引起斑駁及變形等病徵。在西瓜上造成輕微的葉片嵌紋及萎縮。在扁蒲上初期造成新葉輕微斑駁，後期則葉片變小並呈現明顯嵌紋(Hollings et al.,1975)。

      CGMMV最早在歐洲種植的胡瓜上被發現(Ainsworth,1935)，Kobayashi(1990)認為在1966年由帶毒的瓜類種子把CGMMV輸入日本，目前日本除了胡瓜(Tochihara and komuro,1974)外還有西瓜分離株(Komuro et al.,1971)，印度的CGMMV系統則是扁蒲(Lagenaria siceraria)分離株(Vasudava et al.,1949)，同時印度的CGMMV甜瓜系統則會感染甜瓜和南瓜（Raychaudhuri and Varma, 1978) , CGMMV 也是台灣扁蒲上發生相當普遍的一種病毒（王和陳， 1985；許等，1987)，沙烏地阿拉伯第一次發現的 CGMMV 亦是分離自扁蒲（Al-Shahwan and Abdalla,1992）。

      CGMMV 如同其他Tobamovirus一樣，由汁液傳播，且其病毒構造非常穩定，在生體外縱使遇到逆境也不易失去活性，試驗得知其耐熱性 ( TIP ）為80-90℃,耐稀釋性（DEP）為10-6 ，耐保存性（LIV 為20℃下多於 240 天（Hollings et al., 1975) ，因此可經由種媒傳播，亦可藉由污染的土壤或灌溉水傳播( Buttner et al.,1995)，當罹病株殘體留於上中，藉由根部接觸也可感染其他植株（ Avgelis,1992 )，目前尚未確認有何媒介昆蟲可傳播此病毒(Hollings et al., 1975)。
      除中東地區沙烏地阿拉(Al-Shahwan and Abdalla, 1992)及以色列外(Antignus et al., 1990)，CGMMv 的發生僅限於歐洲與亞洲，因此被非疫區國家關切其檢疫問題，尤其種子帶毒可跨國傳播，卻不易由種子上直接檢測出來。Tochihara and Komuro (1974)即認為從印度輸往日本的扁蒲種子保有 CGMMV ，當這些帶毒的扁蒲作西瓜的砧木時，西瓜植株就被 CGMMV 感染了。

      表三呈列有關 CGMMV 在瓜類上經種子傳播的特性之文獻記載，主要發生在胡瓜與扁蒲上。雖然花粉中帶有少最 CGMMV(Hollings et al., 1975)，Simon-Buela and Garcia- Arenal ( 1999 ）也證明CGMMV完幣病毒顆粒在胡瓜植株韌皮部（phloem）中系統性運行的現象，且Faris-Mukhayyish and Makkouk (1983)發現CGMMV感染的胡瓜種子其胚(embryo)與胚乳（endosperm）都帶有病毒，惟胚乳中病毒量較多。

      但是一般認為 CGMMV的種媒現象只是病毒污染到種子外部種皮(Hollings et al.,1975 ; Komuro et al., 1971)，因此種子經過貯存 5 個月後帶毒率從 8%降至 1%(Hollings et al., 1975) ,Yakovleva(1965）也提出種子貯作 2- 3 年，當作防除病毒經種傳播的方法。若以 70 ℃乾熱處理 3 天，亦可去除病毒，而不影響種子發芽。

二、矮南瓜黃化嵌紋病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)

      ZYMV分類上歸屬於Potyviridae科之Potyvirus屬，病毒顆粒呈長絲狀，長度約750nm，具單股核糖核酸(+)ssRNA，及由鞘蛋白組成病毒外鞘。可感染多種葫蘆科作物，在南瓜、甜瓜、胡瓜及西瓜上，造成葉片黃化、嵌紋，植株矮化或萎凋、果實與種子變形，若幼株受感染則無法開花結果，在絲瓜上會造成系統性嵌紋或潛伏感，於紅藜(Chenopodium amaranticolor)或奎藜(Chenopodium quinoa)上則引起非系統性的局部黃斑。

      此外，ZYMV尚可感染莧科之千日紅(Gomphrena globosa)、豆科之菜豆、豌豆等。ZYMV能藉由蚜蟲以非永續性(non-persistent)方式傳播，尤其是棉或桃蚜在病株上吸食數十秒至數分鐘即可獲毒，也就具有傳播病毒的能力(Lisa and Lecoq, 1984)。ZYMV亦可藉由汁液機械傳播，因此農民在進行摘心或採收等田間工作時，徒手或工具接觸到病株莖葉汁液再去處理健株時，病毒即經由傷口侵入健株造成感染，Lecoq et al.(2003)亦證實ZYMV可隨甜瓜果實作長距離傳播。

      ZYMV 於 1951 年在義大利（Lisa et al .,1981）及法國（Lecoq et al.,1981) 同時被確認，台灣也在1984年發現此病毒（許等，1985)，十年內世界五大洲各種瓜類作物幾乎都可發現被 ZYMV 感染的情形，因其快速又廣泛的傳播特性，被懷疑有種媒傳播的能力，但試驗自 ZYMV 感染的瓜實所採的種子，經growing- on test 播種長出的實生苗，證實多數種子皆無媒傳ZYMV 的能力（表四），僅有少數報告涉及ZYMV 在南瓜（Cucurbita pepo及 C. maxima）有種媒傳播力，但其比率極低如表四所示。

      此外，Al-Musa ( 1989）證實 ZYMV 感染的Ranunculus sardous種子所長出的實生苗有1.3 ％是帶有 ZYMV 的，因此可能尚有 ZYMV 的寄主並未被檢測出具種媒傳播的能力。Schrijnwerkers et al. (1991)證實C.pepo罹病株新鮮果實中的種子半數以上可檢測出 ZYMV ，且病毒只存在於外部種皮中，並未入侵至胚。經過正常的採種處理過程，種子乾燥且貯藏後，大多數附著外部的 ZYMV 幾已消滅殆盡，因此病毒感染第二代瓜苗的機會甚低。

      Robinson et al.(1993)報告採自ZYMV感染株的數萬顆南瓜或胡瓜種子，經溫室內 growing-on test，結果第二代瓜苗皆無病毒反應（表四），至於其他試驗中出現的病苗係田間感染，或是 SqMV 等其他病毒造成的病微。

三、南瓜嵌紋病毒(Squash mocsaic virus, SqMV)

      SqMV屬於Comoviridae科之Comovirus屬，具單股核糖核酸(+)ssRNA的基因組組(genome)分散在3種多面體(球形)外鞘內，病毒顆粒直徑都約30nm。其天然寄主限於葫蘆科植物，靠汁液機械接種或咀嚼型口器昆蟲傳播，且有經種子傳播力(Campbell,1971)。

      SqMV的種媒現象是病毒入侵至種胚的結果(Nolan and Campbell,1984)，因此SqMV藉種子傳播與擴散的能力都不能忽視，國內目前仍然沒有SqMV的發生記錄，依「中華民國輸入植物或植物產品檢疫規定」，SqMV列為適用「有條件輸入植物或植物產品之檢疫條件」的有害生物，依據「植物防疫檢疫法第十六條第二項規定」：「輸入之植物或植物產品經檢疫結果證明有其存在，應經適當之檢疫處理，確定該有害生物完全滅除後，始得輸入。無適當之檢疫處理方式可滅除該有害生物時，應予退運或銷燬。」SqMV的發生報告集中於美國，茲將有關的文獻整理如表五。

四、甜瓜壞疽班點病毒(Melon necrotic spot virus, MNSV)

      MNSV屬於Tombusviridae科之Carmovirus屬，單股核糖核酸(+)ssRNA存在於多面體外鞘內，病毒顆粒直徑30mm。天然發生於溫室甜瓜與胡瓜，造成葉與莖的壞斑點。靠汁液機械接種或土壤中Olpidium radicale的游走子傳播(Hibi and Furuki, 1985)。

      此外，Campbell et al.(1996)證實MNSV經種傳播需有另有媒介(vector)即Olpidium bornovanus的協助。MNSV感染的甜瓜在日本經種傳播率為10-15%(Kishi,1966)，在美國加洲則為1-6%(Gonzalez-Garza et al.,1979)。台灣雖然也將MNSV列為適用「有條件輸入植物或植物產品之檢疫條件」的有害生物，但其經種傳播至台灣且立足蔓延的風險較低。

五、甜瓜皺葉嵌紋病毒(Melon rugose mosaic virus, MRMV)

      MRMV屬於Tymovirus屬，單一基因組的單股核糖核酸(+)ssRNA存在於多面體外鞘內，病毒顆粒直徑32nm。自然寄主是西瓜、甜瓜、及蛇瓜，1986(C. melo var. flexuosus)分別有0.9%或3.8%的經種傳播率(Mahgoub et al., 1997)。經解剖觀察，MRMV存在於種皮、胚乳層、及胚中，且經一般種子消毒處理，如0.1N HCl或10%Na3PO4等，都無法消除種子內的病毒(Mahgoub et al.,1997)。MRMV在台灣目前列為適用「有條件輸入植物或植物產品之檢疫條件」的有害生物，針對如此頑強的病毒實施檢疫，必須有特別的措施。

種媒病毒病檢測

      若要對上述五種病毒進行檢疫與防疫措施，必須具備快速診斷鑑定的技術與槮料，其方法很多，最基本的為接種判別寄主試驗，如表六即文獻中記載其鑑別的標準。利用RT-PCR來檢測CGMMV(Antignus et al.,2001)或ZYMV(Lin et al.,2000;Prieto,et al.,2001)的primer設計與反應條件亦如前人所述。但如果同時間內需完成大量標本的病毒檢測時，目前仍以ELISA(Clark and Adams,1977)最為實用，茲將世界上生產上述病毒的抗體且能作診斷試劑組的供應者名單整理如表七。

種媒病毒病防治

      對於瓜類種媒病毒病的防治，需注意各種病毒入侵至種子的程度再擬定策略，如CGMMV，ZYMV，及MNSV並未侵入至種胚，因此只要在採種過程及貯藏處理得當處理得當，病毒存活率即大降，播種前再配合其他病蟲害防治措施，應可預防這類病害的發生。依據日本的「農業病害蟲防除基準」利用乾熱法進行種子消毒的範例，整理如表八。另外可入侵至胚的SqMV或MRMV，經試驗並無法以種子消毒處理去除病毒(Mahgoub et al.,1997)。幸好這兩種病毒並末在台灣發生，只要加強檢疫應可避免這類病害的發生。

針對種媒病毒瓜類種子健康檢查的標準程序(建議)

      由於瓜類作物跨國採種、種源交換或種苗國際貿易的日趨頻繁，病毒經種媒介傳播入境的風險日增，為了其間的檢疫與防疫之需，對於種媒病原的檢測與處理必須有一套標準程序，且放諸四海皆準被世界各國接受 (Kobayashi 1990 ; Maddox ,1997）。因此針對本文所提到的病毒擬訂以下的程序，建議作為瓜類種媒病毒檢測的標準程序。

一、 取樣方式

      種子病害檢測與一般種子檢查的取樣方式相同（ Momson，1999 ) ，遵循國際種子檢查規則的取樣程序，由一批種子（Seed lot）的不同位置逢機抽取原始樣品（Primary sample) ，其取樣頻度（Sampling intensity）依規則所定。再將所有原始樣品組合並混合成複合樣品（Composite sample) ，由部份或全部複合樣品組成送驗樣品（Submitted sample）送往檢測。實驗室從送驗樣品中抽取出來進行檢測的次樣品（ Sub-sample ）即為檢測用樣品 (Working sample)。在此規則下， Maddox ( 1997 ）認為以 SqMv 為檢測目標的供試樣品數為500 -2000 ，Kawi et al.,(1985)則試驗證明CGMMV 的供試樣品數不能少於 800。

二、 檢測技術

1. 出芽試驗(Growing-on test)

      從檢測用樣品中取適量的種子，在環境設定的隔離溫室內播種，觀察苗株是否出現病徵，必要時輔以接種試驗、電子顯微鏡檢查、血清或核酸鑑定等。

2. ELISA

      五種瓜類種媒病毒都可用ELISA檢測，有些且可以直接從種子研磨淬取液中檢測出來，但是因為種子內所帶的病毒數量少且比率低，所以一批種子檢測的結果是偽陰性(false-negative)的機會頗大。若利用出芽試驗，病毒隨寄主生長繁殖，數量已放大至可檢測的程度，再結合ELISA檢測苗組織中的病毒，其結果也才能代表從上一代實際經種傳來的病害發生量。如果供試苗株都無明顯病徵，則建議提高樣品數，且以5株苗的莖葉組織混合研磨當成一個樣品進行ELISA。

三、 結果的計算與表示

      依國際種子檢查規則，檢測結果應以受感染數的面分比，或一定重量樣品內檢出的病毒數表示。至於各種瓜類健康檢查時種子所各種病毒的容許率(Tolerance)則有待訂定，但無論是病害管理或檢疫觀點，MNSV、MRMV、SqMV、及ZYMV，其檢出率應絕對是零。

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