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前言
有鑑於馬鈴薯種薯品質之重要性,農委會防檢局在 98 年制定「馬鈴薯種薯病害驗證作業須知」,並匯集產官學界包括防檢局、中興大學、農業試驗所、臺中區改良場、臺南區改良場以及種苗場組成專家團隊到田間輔導,在團隊的通力合作下,從 G1 種薯就開始,連續繁殖世代 3-4 年的驗證把關。種苗場團隊在田間生產輔導觀察可知,田間不同品種對於晚疫病(Late blight)的抗感病不同,因此引發就本場近年收集之馬鈴薯材料進行抗晚疫病基因分析研究。
馬鈴薯晚疫病
晚疫病由病原真菌Phytophthora infestans (Mont.) de Bary 所引起,是世界性的茄科作物重要病害,病原菌的菌絲或卵胞子殘存於馬鈴薯塊莖或番茄種子上,為本病害的首次感染源。在田間的二次感染傳播途徑主要藉由風雨飛濺或人畜攜帶,可於短時間內做長距離傳播。在台灣冬季低溫恰逢降雨,或是清晨低溫帶霧狀況,(16-22 ℃,相對濕度大於 90-95% ,維持 4-6 小時以上 ),病原菌菌絲會分化為孢囊柄與檸檬狀頂端有乳頭狀孢囊,並在12~15℃低溫刺激下,在受害組織上會產生大量的游走孢子,游走子能藉水膜游動。快速侵染植株,造成大面積的危害,被害部位呈水浸狀黑褐化,被感染部位以上的組織枯萎,嚴重時全株焦枯、死亡,嚴重時如火燒狀 ,造成馬鈴薯收成損失。因此健康種薯、抗(耐)病品種與田間衛生與病害管理為馬鈴薯晚疫病綜合管理之重要環節。
馬鈴薯抗(耐)晚疫病育種分子標誌
抗(耐)病品種篩選,除了傳統抗病育種試驗外,在分子技術的快速發展下,導入分子標誌輔助選拔(marker-assisted selection, MAS)技術,檢測並篩選育種族群中帶有抗(耐)病的單株進行選拔。
針對晚疫病的抗病育種分子標誌的篩選,在同為茄科的野生醋栗番茄Solanum pimpinellifolium上已找到與晚疫病抗性有關的基因座,包括 Ph-1 、Ph-2 及 Ph-3 等,分別定位於第 7、10 和 9 號染色體上。而在馬鈴薯抗病基因研究上,在過去10年研究裡,目前許多馬鈴薯品種的抗病性是由S. demissum (2n = 6X = 72)、S. andigena Hawkes (2N = 4X = 48) 和其他野生種導入。在S. demissum上,已知共有11個R基因。而原產於墨西哥的二倍體馬鈴薯S. bulbocastanum (2n = 2x = 24)也找到部分抗晚疫病基因,如Rpi-blb1基因或稱RB基因,在高發病壓力的環境下也能表現其廣效性的抗性(broad spectrum resistance)。已知在不同的茄屬作物對於晚疫病菌的抗性上,有63個抗性相關基因,其中已在馬鈴薯基因圖譜定位並且經過選殖定序的超過25個,而這些抗病基因的構型皆具備白胺酸重複(leucine-rich repeat, LRR) 及核苷酸鍵結區(nucleotide binding site, NBS)。
抗病基因篩選流程
使用之植物材料主要為種苗場收集之馬鈴薯品種(系),經由組織培養過程保存,確認無特定病原後,進行繼代保存。
馬鈴薯組織培養材料使用DNA Kit抽取。所萃取DNA經核酸定量儀定量為25ng後,作為PCR反應之模板。所偵測抗病基因所用的引子對如,因其最適反應條件設置PCR步驟, PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離後判斷反應增幅條帶,並利用條帶有無的差異性進行抗感病分群。
接種試驗流程
溫室內鑑定晚疫病抗性:選取馬鈴薯品種(系)組織培養材料,經發根培養及馴化後,定植於72格穴盤苗,經8週存活與發根健化後,進行晚疫病接種試驗,接種用的晚疫病菌株(菌株代號為214006與215024)為農業試驗所的安寶貞博士分離保存之菌株(交配型 A-1)。
選出的品系種植至第三片葉長出,並在接種前種植在霧氣室內。接種後保持 100%的相對濕度,與每日10小時光照與14小時黑暗,日夜溫設定為 25/20° C 間,游走子懸浮液配置濃度為 104 zoospores/ml,均勻噴灑至接種植株體。於感病對照組發病後,依據植株病徵表現,進行晚疫病罹病程度的判定,結果如圖四。
結果討論
由試驗結果可知,樣品1號在28種受檢標記中,有24種呈現陽性反應;而另一抗(耐)晚疫病品種-樣品11號則有21種呈現陽性反應。但是在感(不耐)晚疫病品種-樣品10也有多達20種標記呈現抗性標記陽性反應,故推測已有許多抗性標記在臺灣的環境下已失去判別功能。因此,我們以上述三種在臺灣對晚疫病有明確抗感性的馬鈴薯,作來篩選出可能的抗性標記的樣態。
挑出2種抗晚疫病品種及1種感病品種, 進行28種受檢標記的趨集性分析,若抗病品種在該種受檢標記結果為陽性(具備條帶),同時感病品種在該種受檢標記結果為陰性(不具備條帶),則表中呈現雙圈。由表四歸納出抗感病標記有四種,分別為Rpi-abpt (R2-F1/R2-R3)、R3 family (R3-Clade2-F/2,3-R)、Rpi-bt1 (Rpi-bt1-ps),和Rpi-phu1 (OPB07+TG/GT)。此外,Rpi-blb2 (24L)在所有受檢測品種中皆成陽性反應,但在我們的實驗條件下,可看出其表現量在抗(樣品1號和樣品11號)、感(sample 10)品種間有明顯的差異,經重複驗證,結果一致。
R3 family (R3-Clade2-F/2,3-R)僅出現於兩種已知的抗(耐)馬鈴薯品種sample 01和11上,因此可作為抗(耐)品種篩選的標記; 而Rpi-bt1 (Rpi-bt1-ps)和Rpi-phu1 (OPB07+TG/GT)則廣泛出現於供試馬鈴薯中,則不建議作為後續篩選之標地基因。在本次晚疫病接種試驗中,將所測試17種馬鈴薯品種(系)對於所接種的晚疫病菌感受性分作5大群(圖四),僅有一品系呈現抗性表現,其他屬於敏感性及高敏感性。部分基因檢測具抗性之材料尚未進行接種試驗,仍待後續進行接種試驗結果。
未來展望
生物個體對外界環境的具體表現的性狀,由基因直接或間接的操控著。隨著分子生物技術的演變,近代次世代基因解序,甚至是表觀基因體學(epigenetic )的新進展,提供品種判斷、園藝性狀選別、抗病育種篩選等各領域之運用。利用抗(感)病基因分子標誌分群及接種試驗上,可以得到印證。
分子標誌運用在馬鈴薯抗病育種起始於1998年,針對抗馬鈴薯病毒Y(Potato Virus Y )為標的,檢定RYSC3基因標記。繼而開發馬鈴薯黃金線蟲(Globodera rostochiensis)、馬鈴薯包囊線蟲(Globodera pallida )、馬鈴薯病毒A(Potato Virus A )以及本篇所探討的晚疫病。馬鈴薯是全球第4大的糧食作物,運用廣泛,除了食用之外,還包括馬鈴薯加工食品、澱粉加工、畜牧飼料等,世界馬鈴薯的面積一直保持在2,000萬公頃,近10年來,生產區重心逐漸至歐美國家偏轉至亞洲及非洲國家,病蟲害相也隨著栽種區域氣候而改變,利用分子標的選育適當品種,也可加速選育流程。
註:朱映瑞先生為105/106年度分發至種苗改良繁殖場繁殖技術課服務於之替代役男,目前為清華大學醫學生物科技博士候選人,該員於本場服役期間,不吝分享其博士研究內容,不僅協助本課公共事務,更發揮其研究精神,時常與同仁討論研究內容,提供多樣的想法,擴展試驗研究的的廣度與深度。
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