應用直接競爭型酵素免疫分析法檢測農產品中芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利之殘留.pdf - 農業知識入口網

台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 71(2):159–170 (2022) 研究報告
DOI:10.6156/JTAR.202206_71(2).0005
應用直接競爭型酵素免疫分析法檢測農產品中
芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利之殘留
張淑貞1,*　申屠萱2　高靜華3　羅淑卿4　江明耀5
摘要
張淑貞、 申屠萱、高靜華、羅淑卿、江明耀。2022。應用直接競爭型酵素免疫分析法檢測
農產品中芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利之殘留。台灣農業研究 71(2):159–170。
為評估農藥免疫檢測快篩法之農藥把關效能，應用直接競爭型酵素免疫分析 (direct competitive enzyme-
linked immunosorbent assay; dcELISA) 商品檢測農產品中之芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利殘留。此4種
農藥的dcELISA可檢測範圍與檢測極限分別為0.5–100 ng mL-1與0.23–0.52 ng mL-1。小松菜、胡蘿蔔、綠茶、
南瓜、山藥切碎後各外加芬普尼、亞滅培、達滅芬及得克利50 ng mL-1，經萃取、稀釋後以dcELISA檢測農藥，
此4種農藥之回收率各為73.1–123.6%、61.7–111.1%、72.5–102.3%、67.9–113.9%。顯示農藥免疫檢測之靈
敏度高，農藥回收率良好，由檢體萃取至結果判讀僅需1 h，未來可應用在農產品高風險農藥之快篩檢測。
關鍵詞：直接競爭型ELISA免疫檢測、芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利。
前言 儀器昂貴、耗材成本高，且需單件逐一上機分
析，耗費時間長，並需由專業人才操作，不易
針對食品安全，台灣的衛生福利部食品藥
廣設檢驗站，亦無法滿足市售農產品臨場快篩
物管理署 (食藥署) 與行政院農業委員會農糧
把關的需求。
署 (農糧署)，每年都會以公告的『食品中殘留
台灣自1985年開始推廣以家蠅乙醯膽鹼
農藥檢驗方法—多重殘留分析法』抽檢市售農
酯酶及蘇力菌為核心的農藥快篩方法，快速篩
產品上的農藥殘留。『食品中殘留農藥檢驗方
檢農產品上殘留之有機磷、胺基甲酸鹽類等
法—多重殘留分析方法 (五)』於 2019 年 5 月
10日公告修正，可檢驗380品項農藥 (https:// 神經劇毒農藥及部分殺菌劑 (Chiu et al. 1991;
www.fda.gov.tw/TC/)，檢體採用 QuEChERS Cheng et al. 2015; Chang et al. 2016)，經多年
推廣此項技術已廣泛應用於民間單位進行農
(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and
Safe) 方法進行前處理，再以氣相層析串聯質 藥殘留自主把關檢驗，每年抽驗件數逾 100
譜儀 (gas chromatography-tandem mass spec- 萬件。因應劇毒農藥逐年禁用政策，台灣在
trometry, GC/MS/MS) 或液相層析串聯質譜 2014 年開始應用抗原、抗體特異性結合的免
儀 (liquid chromatography-tandem mass spec- 疫學原理，針對市面上常檢出不合格之高風
trometry, LC/MS/MS) 分析農藥。此方法之檢 險農藥，發展農藥免疫檢測快篩技術，隨後
體處理方法複雜且須使用毒性化學物質，分析 在2016年後開始有相關之農藥免疫檢測快篩
投稿日期：2021 年10月17日；接受日期：2022 年2月25日。
* 通訊作者：scchang@tari.gov.tw
1 農委會農業試驗所應用動物組副研究員。台灣 台中市。
2 農委會農業試驗所應用動物組技佐。台灣 台中市。貢獻度等同第一作者。
3 農委會農業試驗所應用動物組前研究員兼組長。台灣 台中市。
4 農委會農業試驗所農業化學組助理研究員。台灣 台中市。
5 農委會農業試驗所應用動物組助理研究員。台灣 台中市。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 115599 22002222//66//1133 下下午午 0022::2255::5588160 台灣農業研究　第71卷　第2期
商品上市 (Chang et al. 2018)。農藥免疫檢測 多種作物上之薊馬、粉蝨、蚜蟲、黃條葉蚤等
技術係應用免疫學原理，研發可辨識特定農藥 重要害蟲防治。達滅芬為肉桂醯胺類 (cinnam-
的抗體，再結合膠體金側流免疫分析技術 (col- ic acid amides) 殺真菌劑，具局部系統移行
loidal-gold based lateral-flow immunoassay) 性，可抑制疫病 (phytophthora diseases)、露
或酵素連結免疫吸附分析 (enzyme-linked im- 菌病 (downy mildew) 等病原真菌之菌絲及游
munosorbent assay; ELISA) 技術，製成檢測試 走孢子生長 (Cohen et al. 1995; Reuveni 1997;
劑，可用於快篩農產品中的農藥殘留。其中直 Ann et al. 2015)，在台灣常用於防治多種根莖
接競爭型酵素免疫分析(direct competitive ELISA; 類、果菜類及葉菜類作物之疫病與露菌病。得
dcELISA) 較適合用來發展為農藥檢測之商 克利為三唑類 (triazoles) 殺真菌劑，具系統移
品，因其已將農藥抗體固定在微量盤，實際操 行性，兼具保護及治療性效果 (Brenneman &
作時，只要加入待測農藥與酵素-農藥半抗原 Culbreath 1994; Rial-Otero et al. 2005; Paul
結合體，二者同時競爭與農藥抗體結合的機 et al. 2007)，用於防治多種作物之炭疽病 (an-
會，經洗滌去除游離部分後，與農藥抗體結 thracnose) 與瓜果類白粉病 (powdery mildew)
合之酵素-農藥半抗原會被固定在盤底，再加 (Wong & Midland 2007; Xu et al. 2014; Kein-
入受質呈色並經光譜儀偵測，即可經由顏色深 ath 2015)。此 4種農藥除芬普尼目前禁用外，
淺，來推得待測樣品中之農藥含量，日本、美 其餘皆為台灣農作物上普遍使用的農藥。食藥
國已有相關產品 (Watanabe et al. 2004, 2005; 署於 2010–2017 年間抽驗市售農產品農藥殘
Kranthi et al. 2009; Yamasaki et al. 2015)。台 留，達滅芬檢出違規率則每年皆在前3名，芬
灣現也有 4 合 1 農藥 ELISA 試劑套組，應用 普尼、亞滅培、得克利則輪流名列前4名，顯
dcELISA，在同一 ELISA 96孔盤中同時檢測 示此4種農藥在台灣違規使用風險較其他農藥
芬普尼 (fipronil)、亞滅培 (acetamiprid)、達滅 高，宜加強殘留檢測 (Hou et al. 2019)。
芬 (dimethomorph)、得克利 (tebuconazole) 等 為評估農藥免疫檢測快篩法在現有農藥生
4種農藥，依其說明書言檢測極限各為0.68、 化快篩系統中，強化農藥把關效能之可行性，
1.14、0.23、0.61 ppb，皆較『食品中殘留農藥 故擬評估農藥免疫檢測快篩法與農藥生化快篩
檢驗方法—多重殘留分析方法(五)』中，上述 法檢體萃取液共用之可行性。因農藥生化快篩
4種農藥之檢測極限1–50 ppb低，應可嘗試應 法中，農產品中的農藥以乙醇萃取，萃取液中
用在農產品農藥殘留檢測。其中芬普尼、亞滅 植體切碎後釋出之干擾物質與乙醇是否會降低
培為殺蟲劑，達滅芬、得克利為殺菌劑。芬普 農藥抗體之檢測極限，影響農藥抗體之農藥辨
尼為苯吡唑類 (phenylpyrazoles) 殺蟲劑，對 識能力，皆有待進一步地確認，故進行本研究。
昆蟲兼具接觸毒與胃毒，對非目標昆蟲如蜜蜂
毒性高且會降低雄蜂生育力 (Mayer & Lunden 材料與方法
1999; Yu 2008; Kairo et al. 2017)。台灣已於
藥劑與儀器
2017 年公告禁用 4.95% 芬普尼水懸劑，但依
據農糧署於 2019 年 1 月至 2020 年 6 月農作 試驗中使用的49類共93種農藥詳如附錄，
物農藥殘留檢測的月報表，每月皆有農產品被 有些農藥因為已在台灣農業禁用，故改購入高純
驗出芬普尼不當殘留 (https://www.afa.gov.tw/ 度之標準品，如芬普尼標準品 (96%純度) 購自
cht/)，顯示芬普尼仍有違規使用情形。亞滅培 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany)，
為新尼古丁類系統性殺蟲劑，具高水溶性，其 商品農藥亞滅培 (20% soluble powder; SP)、
作用機制是與尼古丁乙醯膽鹼受體 (nicotinic 達滅芬 (50% wettable powder; WP) 購自興農
acetylcholine receptor) 結合，干擾乙醯膽鹼神 股份有限公司 (台灣台中市)，得克利 (25.9%
經訊息之傳遞，造成昆蟲過度興奮並癱瘓而死 emulsifiable concentrate; EC) 購自台灣拜耳股
亡 (Tomizawa & Casida 2005; Yu 2008)，在台 份有限公司 (台灣台北市)。其中芬普尼標準
灣可用於茶、十字花科包葉菜類、小葉菜類等 品因在水中的溶解度僅 2 mg L-1，故以甲醇先
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 116600 22002222//66//1133 下下午午 0022::2255::5588酵素免疫分析檢測農藥殘留 161
配製成2 mg mL-1 stock solution，其餘 3種商 亞滅培、達滅芬及得克利辨識力之專一性，依
品農藥則以100 mM phosphate buffered saline 據農藥特性篩選待測農藥，包括與上述4種標
(PBS) buffer配製成2 mg mL-1 stock solution， 的農藥結構相似的農藥，及與上述4種農藥結
存放於4℃，試驗前再稀釋至所需濃度。芬普 構相異之非標的農藥，全部共49類93種農藥，
尼、亞滅培、達滅芬、得克利直接競爭型免 包括殺蟲劑、殺菌劑及除草劑等，詳如附錄。
疫檢測試劑組購自費司科技有限公司 (台灣台 因為未來擬應用在農產品檢驗，故以商品農藥
中市)。ELISA 以 96 孔微量盤酵素免疫分析 為測試標的，若為台灣已禁用、無法購得商品
儀 (ELx808™ Absorbance Microplate Reader) 農藥，則改以高純度之農藥標準測試。
(Biotek,Winooski, VT, USA) 及微量盤清洗儀 以交叉反應率檢視農藥抗體之專一性，
(Wellwash™ Microplate Washer) (Thermo Fish- 交叉反應率 = (標的農藥之 IC50/非標的農藥
er Scientific, Waltham, MA, USA) 進行。 之 IC50) × 100% (Li et al. 2015)。當交叉反
dcELISA 之檢測極限 應率小於0.1%時，非標的農藥在此ELISA之
IC50 大於標的農藥1,000×，表示此標的農藥
參考芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利直
ELISA辨識力之專一性良好。故依據上述4種
接競爭型免疫檢測試劑組使用說明，為能應用
標的農藥的標準檢量線，推算各標的農藥在
標準檢量線估算檢體中的農藥濃度，故以內含
50% 抑制率時的農藥濃度 (IC50)。將待測農
1.9%乙醇的樣品萃取稀釋液配製上述4種農藥，
藥的濃度配製為此濃度的 1,000×，再以上述
濃度各為0、0.5、1、3、10及100 ng mL-1，每
ELISA 步驟進行反應，若 ELISA 之抑制率小
個濃度進行 3 重複，分別建立此 4 種農藥之
於 50%，即表示此標的農藥 ELISA 與待測農
標準檢量線。分別取上述各農藥50 μL逐一注
藥之交叉反應率小於0.1%。若 ELISA之抑制
入試劑組內已吸附此4種農藥抗體的微量孔盤
率大於50%，則將待測農藥配製多個濃度，進
中；再各別加入此4種農藥的農藥-酵素結合
行 ELISA 後，建立其農藥濃度 log 值與吸光
體，至含相應抗體的微量孔中，每孔50 μL，
值抑制比間的回歸線，據以推算其 IC50，並
於室溫靜置30 min後，甩掉微量孔盤中的反應
根據上述公式算出交叉反應率。
液。每孔加入200 μL清洗液，於微量盤清洗
儀中震盪10 s、靜置 1 min、倒掉清洗液，重 植物檢體前處理與農藥回收率
複 3 次。最後一次清洗後拍乾清洗液，加入
參考芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利直
100 μL 受質液，於室溫靜置10 min，進行呈
接競爭型免疫檢測試劑組使用說明，以小松
色反應。再於每孔加入50 μL終止液，終止反
菜、紅蘿蔔、綠茶、山藥、南瓜等5種市售農
應，並以微量盤酵素免疫分析儀記錄 450 nm
產品進行農藥回收率測試，試驗檢體均為有機
波長的吸光值。
認證產品，並經水沖洗10 min，每種農產品皆
以上述各農藥進行 ELISA 後的吸光值
取樣3重複，小松菜每株為1重複，紅蘿蔔、
為 B，對照組無放置農藥時吸光值為 B ，計
0 山藥、南瓜每條為1重複，綠茶每罐為1重複。
算吸光值抑制比B/B ，抑制率 = (1 − B/B ) ×
0 0 為確認此方法是否可檢測以農藥生化快篩法萃
100%。將各農藥濃度取 log 值後，與其相應
取之檢體萃取液，故取樣重量依據農藥生化快
之吸光值抑制比進行直線回歸分析，得一直線
篩法 (Chiu et al. 1991) 調整，即小松菜0.5 g，
回歸方程式。將抑制比0.9帶入此直線回歸方
綠茶1 g，紅蘿蔔、山藥、南瓜各 1.5 g。首先
程式，計算出的農藥濃度，即為此農藥ELISA
將各檢體切碎，放入直徑1 cm、高7 cm之玻璃
抑制率達10%時的農藥濃度 (10% inhibitory
試管，分別加入95%乙醇1 mL，再分別加入
concentration; IC10)，即為檢測極限。農藥檢測
各配製成50 mg L-1的芬普尼、亞滅培、達滅芬
範圍則為吸光值抑制比0.2–0.8間的農藥濃度。
及得克利各 10 μL，使萃取液各含有0.5 mg mL-1
交叉反應 (cross-reactivity; CR) 農藥，震盪 20 s 後靜置 3 min。從每管取出
為確認此試劑組對4種標的農藥芬普尼、 30 μL 酒精萃取液至另一新試管中，分別加
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入 1,470 μL 萃取稀釋液。取前述萃取稀釋液 與相應各農藥濃度log值間的直線回歸分析如
各50 μL分別加入含此4種農藥抗體之微量孔 (圖 1)，R2值皆在 0.9899–0.9948 間，可檢測
盤，再個別加入此4種農藥的農藥-酵素結合 範圍皆為 0.5–100 ng mL-1。各依其直線回歸
體，每孔 50 μL，其餘依前述 dcELISA 步驟 方程式估算，芬普尼、亞滅培、達滅芬及得克
進行反應，再經由上述建立之4種農藥的直線 利檢測極限 (IC10) 依序為 0.30、0.52、0.23
回歸方程式推算檢體所含農藥濃度，並據此計 及0.39 ng mL-1。
算農藥回收率。如以吸光值抑制比B/B 與添加 交叉反應
0
的農藥濃度 (log值) 建立直線回歸方程式y =
測試此試劑組所含之芬普尼、亞滅培、達
ax + b，檢體萃取液中之農藥濃度 = POWER
滅芬、得克利等 4 種農藥抗體與 49 類 93 種
{(10, [(檢體的 B/B 值 – b)/a]}。農藥回收率
0 農藥之交叉反應率，其中芬普尼抗體對與其
= (檢體萃取液中之農藥濃度/實際添加之農藥
化學結構相近的農藥益斯普之交叉反應率為
濃度) × 100%，檢測方法可信度之管制範圍為
40.1%，亞滅培對與其結構相近的類尼古丁類
60–140%農藥回收率 (Hsu et al. 2014)。
藥劑賽果培、益達胺、賽速安、可尼丁之交叉
反應率各為 47.6、31.3、1.0 及 0.8% (表 1)，
結果 除此之外，此4種農藥抗體對其餘農藥的交叉
反應率皆小於0.1%。顯示此試劑組對亞滅培、
dcELISA 之檢測極限
芬普尼、達滅芬及得克利農藥之專一性。
芬普尼、亞滅培、達滅芬及得克利等4種
植物檢體前處理與農藥回收率
農藥各配製成5種濃度，進行直接競爭型ELI-
SA。各農藥與對照組之間的吸光值抑制比， 以此試劑組進行芬普尼、亞滅培、達滅芬
B0
B/
圖1.　芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利之dcELISA抑制曲線。每個點為3個重複的平均值。
Fig. 1.　Inhibition curves of fipronil, acetamiprid, dimethomorph and tebuconazole in the direct competitive en-
zyme-linked immunosorbent assay (dcELISA). Each point is the average of triplicate determinations. IC10: 10%
inhibitory concentration.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 116622 22002222//66//1133 下下午午 0022::2255::5599酵素免疫分析檢測農藥殘留 163
表1.　芬普尼、亞滅培、達滅芬及得克利抗體在直接競爭型酵素免疫分析中對其他非目標農藥之交叉反應。
Table 1.　Cross-reactivity of the non-target pesticides to fipronil, acetamiprid, dimethomorph, and tebuconazole anti-
bodies in the direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dcELISA).
Cross-reactivity (%)z
Pesticide Fipronil Acetamiprid Dimethomorph Tebuconazole
Phenylpyrazoles
Fipronil 100.0 < 0.1 < 0.1 < 0.1
Ethiprole 40.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
Other 91 pesticidesy < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
Neonicotinoid
Acetamiprid < 0.1 100.0 < 0.1 < 0.1
Thiacloprid < 0.1 47.6 < 0.1 < 0.1
Imidacloprid < 0.1 31.3 < 0.1 < 0.1
Thiamethoxam < 0.1 1.0 < 0.1 < 0.1
Clothianidin < 0.1 0.8 < 0.1 < 0.1
Other 88 pesticidesy < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
Cinnamic acid amides
Dimethomorph < 0.1 < 0.1 100.0 < 0.1
Other 92 pesticidesy < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
Triazoles
Tebuconazole < 0.1 < 0.1 < 0.1 100.0
Other 92 pesticidesy < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
z Cross-reactivity was calculated as (IC50 of target pesticide/IC50 of other pesticide) × 100%. IC50: 50% inhibitory concentration.
y Pesticides tested were listed in the appendix.
及得克利在小松菜、紅蘿蔔、綠茶、山藥、南 能，以含5%甲醇之水溶液配製克凡派各濃度，
瓜等 5 種農產品農藥回收率評估。取樣重量 確認其 dcELISA 檢測範圍在 1–10 ng mL-1，
依據農藥生化快篩法調整，即小松菜 0.5 g， 檢測極限為0.1 ng mL-1；Watanabe & Miyake
綠茶1 g，紅蘿蔔、山藥、南瓜各 1.5 g，各加 (2013) 測試殺蟲劑賽速安 dcELISA 試劑組的
入乙醇1 mL，每個檢體再加入上述 4種農藥。 檢測範圍為0.1–4.1 ng mL-1，檢測極限為0.1
檢測得知芬普尼、亞滅培、達滅芬及得克利在 ng mL-1；Liu et al. (2012) 研發數個可檢測有機磷
上述5種農產品上的回收率各為73.1–123.6%， 劑類殺蟲劑的抗體，最靈敏的抗體對甲基巴拉
61.7–111.1%、72.5–102.3%及67.9–113.9%， 松之抑制比0.85時的檢測濃度為2.1 ng mL-1。
本研究測試芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利
各重複間之CV值皆小於14.8% (表2)。農藥
回收率皆在 60–140% 管制範圍內，精確度與 4合1農藥ELISA 試劑組之檢測極限及檢測範
圍皆與前述文獻相當。
目前食藥署公告之檢驗方法相當 (Hsu et al.
在檢體處理方面，由於多數農藥非水溶
2014)。
性，現今國內農藥檢驗方法中的檢體處理多以
有機溶劑萃取，但有機溶劑會對抗體蛋白質中
討論
的氫鍵等結構作用力產生影響，干擾農藥與抗
芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利直接競 體的鍵結，進而影響農藥ELISA 時的靈敏度
爭型免疫檢測試劑組之檢測極限在0.23–0.52 (Yang et al. 2008)。農業試驗所研發的『農藥殘
ng mL-1之間，其靈敏度足以檢測國內訂定容 毒快速檢驗方法』即生化快篩法，則使用乙醇
許量1 mg kg-1之作物上的農藥。Watanabe et 萃取農藥，對試驗操作者較為安全 (Chiu et al.
al. (2005) 評估克凡派 ELISA 試劑之檢測效 1991)。Watanabe et al. (2004, 2005) 測試萃取
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表2.　應用直接競爭型酵素免疫分析組檢測外加農藥於農產品上之農藥回收率。
Table 2.　Recovery of the pesticides from agricultural samples with the direct competitive enzyme-linked immuno-
sorbent assay (dcELISA) kit.
Pesticide recovery rate (CV) (%)z
Sample Fipronil Acetamiprid Dimethomorph Tebuconazole
Komatsuna 105.3 (3.8) 74.0 (3.3) 92.8 (3.8) 92.1 (6.9)
Carrot 123.6 (5.7) 111.1 (6.2) 88.0 (6.0) 72.1 (5.3)
Yam 73.1 (5.3) 61.7 (4.0) 102.3 (4.9) 92.7 (3.7)
Pumpkin 98.6 (6.2) 73.8 (14.8) 72.5 (3.3) 113.9 (5.0)
Green tea 84.8 (2.1) 83.3 (6.7) 78.2 (6.9) 67.9 (6.7)
z Pesticide recovery rate (%) = (pesticide detected in sample/pesticide added in sample) × 100%. CV: coefficient of variation.
液含 5% 甲醇、5% 乙醇、5% 丙酮、5% 乙腈 mg mL-1。以達滅芬為例，多數作物的達滅芬
(acetonitrile) 等 4 種溶劑對克凡派 dcELISA 殘留容許量在1.0–10.0 ppm，相當於 1.0–10.0
的影響，結果顯示甲醇與乙醇對農藥抗體與農 mg mL-1，應用此試劑組的檢測極限足以檢測
藥間結合的量影響最小，可做為萃取用溶劑。 小葉菜類含達滅芬的殘留。
前述文獻亦測試檢液含甲醇1–30% 對殺菌劑 農藥免疫檢測是應用抗體與抗原特異性結
四氯異苯腈 (chlorothalonil) ELISA 的影響， 合的原理，所發展之新一代的農藥殘留快篩
得知含甲醇量越高，吸光值越低，即對農藥抗 技術，應用直接競爭型 ELISA 搭配免疫分析
體與農藥間結合的抑制越大，降低此 ELISA 儀，可一次同時檢測多件樣品。本研究測試
檢測的靈敏度，濃度不宜高於5%。本研究採 芬普尼、亞滅培、達滅芬、得克利直接競爭型
用檢體前處理的方法係參考農業試驗所發展的 免疫檢測試劑組，評估其應用在小葉菜類的
生化快篩法，使用 95% 乙醇萃取農產品檢體 小松菜、根菜類的紅蘿蔔及山藥、瓜菜類的
上的農藥，為避免過高的乙醇成分干擾 ELI- 南瓜、茶類的綠茶等作物中殘留農藥的檢測
SA，將此乙醇萃取液稀釋 50×，使萃取稀釋液 可行性，結果顯示此 4 種農藥的回收率介於
僅含1.9%乙醇，再進行ELISA，可避免有機 61.7–123.6%，coefficient of variation (CV) 值
溶劑對分析結果的干擾，同時也可降低檢體的 介於 2.1–14.8%，具有穩定的回收率及良好的
基質干擾情形，使回推檢體上的農藥濃度更為 重複性。
準確。 農藥快篩方法是以快速、簡便、準確為發
檢測方法在檢體之檢測極限是指應用此方 展原則，當精準的公告檢驗方法因為價格、設
法在檢體上能檢測到的農藥最低濃度，此與檢 備、人力、耗時等限制，無法擴大抽驗數量時，
體農藥萃取方法與後續萃取液的稀釋倍數有 農藥快篩方法包括免疫快篩及生化法皆可在農
關。以小葉菜為例，此方法取 0.5 g小葉菜， 藥初篩階段發揮把關功能，大量且快速的攔截
以 1 mL 乙醇萃取農藥，此時農藥濃度稀釋 殘留農藥過量的農產品，提升公告檢驗方法效
2×，此萃取液再稀釋 50× 才進入 ELISA，檢 率。未來若能應用日益精進的分析技術，如微
體上的農藥濃度共稀釋 100×。根據前述芬普 流體晶片技術、奈米免疫層析技術 (Khizar et
尼、亞滅培、達滅芬及得克利 dcELISA 之直 al. 2020; Stueber et al. 2021; Wu et al. 2021,
線回歸方程式所推估出之檢測極限各為0.30、 2022)，縮減檢驗步驟，提升操作便利性，拓
0.52、0.23 及 0.39 ng mL-1，加上此 100× 的 展可檢驗的農藥種類，當更能符合農產品農藥
稀釋倍數，可推估此方法檢測植物檢體中含 快篩應用需求。若再能連結以乙醯膽鹼酯酶為
上述4種農藥的檢測極限為30、52、23及39 基礎的農藥快篩生化法，將更能擴大農藥快篩
ng mL-1，相當於0.030、0.052、0.023及0.039 效能，提升農產品食用安全。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 116644 22002222//66//1133 下下午午 0022::2266::0000酵素免疫分析檢測農藥殘留 165
誌謝 Y. C. Huang, F. Chou, H. L. Tao, M. C. Lu, C. Y.
Lu, P. Y. Chen, C. M. Chen, T. L. Chiu, and H. Y.
本研究承行政院農業委員會 106 農科- Wang. 2019. Monitoring of pesticide residues in ag-
12.2.4-農-C1計畫經費補助。試驗期間承吳森 ricultural products on markets in 2018. Ann. Rept.
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源先生、朱雅琳小姐、蕭妤芳小姐、楊侑蓁小
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姐協助相關試驗執行，謹此致謝。
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附錄.　應用於交叉反應試驗之農藥含括49類共93種農藥。
Appendix.　Pesticides including 93 pesticides in 49 categories were used in the cross-reactivity tests.
Classification Mode of action Pesticide Manufacturer
Insecticidez 1A Carbofuran Dr. Ehrenstorfer GmbH
Methomyl Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oxamyl DuPont Taiwan Ltd.
Propoxur Dr. Ehrenstorfer GmbH
Carbaryl Dr. Ehrenstorfer GmbH
1B Profenofos Dr. Ehrenstorfer GmbH
Acephate Dr. Ehrenstorfer GmbH
Fenitrothion Dr. Ehrenstorfer GmbH
Disulfoton Dr. Ehrenstorfer GmbH
Chlorpyrifos Sinon Corp., Taiwan
2B Fipronil Dr. Ehrenstorfer GmbH
Ethiprole Sinon Corp., Taiwan.
3A Cypermethrin Sinon Corp., Taiwan.
Deltamethrin Sinon Corp., Taiwan.
Fenvalerat Sinon Corp., Taiwan.
Cyhalothrin Dr. Ehrenstorfer GmbH
alpha-Cypermethrin Dr. Ehrenstorfer GmbH
Fenpropathrin Sinon Corp., Taiwan.
Bifenthrin Sinon Corp., Taiwan.
Permethrin Sinon Corp., Taiwan.
4A Acetamiprid Sinon Corp., Taiwan.
Imidacloprid Bayer Taiwan Ltd.
Thiamethoxam Syngenta Taiwan Ltd.
Thiacloprid Bayer Taiwan Ltd.
Clothianidin Lih-Nung Co., Taiwan Ltd.
Dinotefuran Alfa Co., Taiwan Ltd.
5 Spinosad Dow AgroSciences Taiwan Ltd.
6 Abamectin Sinon Corp., Taiwan.
Emamectin benzoate Syngenta Taiwan Ltd.
Milbemectin Mitsui-Chem., Taiwan Ltd.
7 Fenoxycarb Agrowaho Co., Taiwan Ltd.
Pyriproxyfen Sinon Corp., Taiwan.
9 Pymetrozine Sinon Corp., Taiwan.
10A Clofentezine Lanlix Corp. Sci. Co., Taiwan Ltd.
Etoxazole Lih-Nung Co., Taiwan Ltd.
11 Bacillus thuringiensis Sumitomo Co., Taiwan Ltd.
12 Diafenthiuron Sinon Corp., Taiwan.
Bromopropylate Worldwide Agrochem. Co., Ltd.
13 Chlorfenapyr BASF Taiwan Ltd.
14 Cartap hydrochloride Sinon Corp., Taiwan.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 116677 22002222//66//1133 下下午午 0022::2266::0000168 台灣農業研究　第71卷　第2期
附錄.　應用於交叉反應試驗之農藥含括49類共93種農藥。(續)
Appendix.　Pesticides including 93 pesticides in 49 categories were used in the cross-reactivity tests. (continued)
Classification Mode of action Pesticide Manufacturer
15 Flufenoxuron BASF Taiwan Ltd
Teflubenzuron Dr. Ehrenstorfer GmbH
Chlorfluazuron FMC Co., Taiwan Ltd.
16 Buprofezin Dr. Ehrenstorfer GmbH
17 Cyromazine Dr. Ehrenstorfer GmbH
18 Tebufenozide Agrowaho Co., Taiwan Ltd.
19 Amitraz FMC Co., Taiwan Ltd.
20B Acequinocyl Chia Tai Co., Taiwan Ltd.
21A Fenpyroximate Nihon Nohyaku Co., Taiwan Ltd.
Pyrimidifen Sinon Corp., Taiwan.
Tebufenpyrad HKC Co., Taiwan Ltd.
Fenazaquin Nihon Nohyaku Co., Taiwan Ltd.
22A Indoxacarb FMC Co., Taiwan Ltd.
23 Spirodiclofen Bayer Taiwan Ltd.
28 Chlorantraniliprole FMC Co., Taiwan Ltd.
UN Dicofol Harvest Chemical Co., Ltd.
Bifenazate United Phosphorus Ltd.
Fungicidey B1 Carbendazim Sinon Corp., Taiwan.
Thiabendazole Sinon Corp., Taiwan.
B4 Pencycuron HKC Co., Taiwan Ltd.
C2 Oxycarboxin Tong Ho Chem. Co., Taiwan Ltd.
Boscalid Dr. Ehrenstorfer GmbH
C3 Pyraclostrobin BASF Taiwan Ltd
Trifloxystrobin Bayer Taiwan Ltd.
Kresoxim-methyl Dr. Ehrenstorfer GmbH
Azoxystrobin Wonderful Agriculture Co., Ltd.
Famoxadone Cymoxanil DuPont Taiwan Ltd.
C5 Fluazinam Ya Chung Co., Taiwan Ltd.
E1 Quinoxyfen Dow AgroSciences Taiwan Ltd.
E2 Cyprodinil fludioxonil Syngenta Taiwan Ltd.
E3 Procymidone Lih-Nung Co., Taiwan Ltd.
Iprodione Sinon Corp., Taiwan.
F2 Edifenphos Sinon Corp., Taiwan.
F3 Etridiazole United Phosphorus Ltd.
G1 Tebuconazole Bayer Taiwan Ltd.
Difenoconazole Sinon Corp., Taiwan.
Hexaconazole HKC Co., Taiwan Ltd
Flutriafol Dr. Ehrenstorfer GmbH
Prochloraz Sinon Corp., Taiwan.
G2 Tridemorph Alfa Co., Taiwan Ltd.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 116688 22002222//66//1133 下下午午 0022::2266::0000酵素免疫分析檢測農藥殘留 169
附錄.　應用於交叉反應試驗之農藥含括49類共93種農藥。(續)
Appendix.　Pesticides including 93 pesticides in 49 categories were used in the cross-reactivity tests. (continued)
Classification Mode of action Pesticide Manufacturer
H5 Dimethomorph Sinon Corp., Taiwan.
I1 Tricyclazole Sinon Corp., Taiwan.
M2 Sulfur Sinon Corp., Taiwan.
M3 Mancozeb Sinon Corp., Taiwan.
M5 Chlorothalonil Ihara Chemical Co, Ltd.
Herbicidex C1 Ametryn Alfa Co., Taiwan Ltd.
C2 Diuron Wonderful Agriculture Co., Ltd.
D Paraquat Sinon Corp., Taiwan.
G Glyphosate-isopropylammonium Sinon Corp., Taiwan.
H Glufosinate ammonium Sinon Corp., Taiwan.
K1 Pendimethalin Sinon Corp., Taiwan.
K3 Butachlor Sinon Corp., Taiwan.
O 2,4-D Sigma Aldrich
z Including 57 pesticides in 24 categories by Insecticide Resistance Action Committee (IRAC).
y Including 28 pesticides in 17 categories by Fungicide Resistance Action Committee (FRAC).
x Including 8 pesticides in 8 categories by Herbicide Resistance Action Committee (HRAC).
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 116699 22002222//66//1133 下下午午 0022::2266::0000170 台灣農業研究　第71卷　第2期
Detection of Fipronil, Acetamiprid, Dimethomorph
and Tebuconazole Residues in Agricultural Samples
with Direct Competitive Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay
Shu-Chen Chang1,*, Hsuan Shentu2, Ching-Hua Kao3, Shu-Chin Lo4, and Ming-Yao Chiang5
Abstract
Chang, S. C., H. Shentu, C. H. Kao, S. C. Lo, and M. Y. Chiang. 2022. Detection of
fipronil, acetamiprid, dimethomorph and tebuconazole residues in agricultural samples with
direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay. J. Taiwan Agric. Res. 71(2):159–
170.
In order to evaluate the rapid screening efficiency of pesticide immunoassay, a commercial
direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dcELISA) was conducted to detect the resi-
dues of fipronil, acetamiprid, dimethomorph, and tebuconazole in agricultural samples. The detectable
range and the detection limit of these four pesticides by this dcELISA kit were 0.5–100 ng mL-1 and
0.23–0.52 ng mL-1, respectively. Agricultural samples such as komatsuna, carrots, green tea, pumpkin,
and yam were chopped and each added with fipronil, acetamiprid, dimethomorph, and tebuconazole to
50 ng mL-1. After extraction and dilution, residual pesticides were detected by dcELISA. The recov-
ery rates of these four pesticides were 73.1–123.6%, 61.7–111.1%, 72.5–102.3% and 67.9–113.9%,
respectively, which indicated immunoassay has high sensitivity and a good recovery rate. It takes only
one hour from sample extraction to result interpretation, and is adequate for rapid screening of pesti-
cide residues for agricultural products with high risk or known pesticide application records.
Key words: Direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dcELISA), Fipronil, Acetami-
prid, Dimethomorph, Tebuconazole.
Received: October 17, 2021; Accepted: February 25, 2022.
* Corresponding author, e-mail: scchang@tari.gov.tw
1 Associate Research Fellow, Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
2 Junior Technical Specialist, Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC. Co-first
author.
3 Former Research Fellow and Division Director, Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City,
Taiwan, ROC.
4 Assistant Research Fellow, Agricultural Chemistry Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
5 Assistant Research Fellow, Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0055 張張淑淑貞貞..iinndddd 117700 22002222//66//1133 下下午午 0022::2266::0000