次世代定序(Next Generation Sequencing)升級運用讓病原無所遁形
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文章來源：種苗改良繁殖場 2018/06/27
自2005年羅氏(F. Hoffmann-La Roche AG,Roche)公司推出第一台次世代定序儀，至今已經13年，次世代定序技術(Next Generation Sequencing,NGS)依舊沸沸揚揚，依據近3年在美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)登載搜尋，近3年NGS文獻發表皆有6-7千多篇研究文獻持續發表，其中發表主題逐漸從基礎技術開發，轉向為個人醫療及精準醫學檢定技術的升級運用。
運用NGS於農業領域的研發雖不似人類醫學研究吸睛，但因NGS技術穩定開發，檢定分析成本大幅下降，在病原檢定技術有跳躍式進展。
過去病原檢定必須了解特定病原生物特性，如寄主範圍、病徵表現，並具備培養環境、分子序列資訊或是檢定用血清庫等，方能針對特定病原進行檢定，之後以使用的目的性，進行去病原處理如莖頂組織培養技術、熱處理技術、或是抗生素等藥劑處理，已達去除特定病原之目的，獲得無特定病原(specific pathogen-free,SPF)繁殖材料。在國際植物種原首次輸入引進，皆需要針對輸出國病害進行風險評估，常因為輸出國疫情不明或研究資訊不足、取得困難，導致輸入引進時程緩慢，影響後續研發。甚者有以不當管道攜入罹染特定病原的植物材料，導致外來有害生物入侵輸入國之情況。
運用NGS技術於植物病理研究，不僅可作為病理研究、病原偵測、流行病學族群分析等，也可藉由RNA-sequencing分析罹病過程中寄主與病原生物的交替作用，寄主植物病程各階段的基因表現與病徵相關性。病原偵測上，可藉由單一物種複合材料的RNA全定序、DNA定序與病原資料庫比對，瞭解該作物病原的族群相，在多樣品的集合下，瞭解特定作物的病原相與區域的演化差異。
位在美國紐約康乃爾大學校區的波伊斯植物研究院(Boyce Thompson Institute)與國際馬鈴薯中心(International Potato Center，簡稱CIP)於2017年發表小分子核醣核酸(small RNA)分析軟體「VirusDetect」，在取得樣品的小分子核醣核酸序列資料後，去除轉接子(adapter)序列後，上傳分析系統，執行自動化串聯分析，先將小片段序列連結成較長的接合序列(contig 或consensus sequence)，以BLASTN及 BLASTX演算分析並比對NCBI資料庫，演算時間依照小分子核醣核酸序列資料大小，約30分鐘至2小時不等，即可比對出在待測樣品中，可能存在的微生物。該團隊運用CIP的馬鈴薯材料，成功偵測到待測樣品中含有之前無法有效鑑別的馬鈴薯病毒。該團隊更進一步以產生病毒病徵的雜草作為分析對象，在完全無病原資料庫的情況下，以small RNA進行VirusDetect分析，成功比對出罹染的病毒，並經反轉錄酶聚合酶反應(Reverse Transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)及基因解序比對確認病毒。
NGS技術運用的普及性，與耗材、儀器及分析成本逐漸下降有關，試驗人員可藉由計畫技術合作與大專院校租借高規格的電腦資訊空間，並利用雲端操控資料存取，進行工作流程(work flow)設定，納入定序技術來增加相關研究的深度。而種苗改良繁殖場開發健康種苗無特定病原(Specific pathogen free,SPF)，並利用組織培養技術進行保種與產程規劃與繁殖，過去在產程病理檢定，以分子檢定及血清技術為主。為擴大研發量能與杜絕檢測標地受限，也將在具有開發潛力的種苗，導入小分子NGS分析，使得病毒無所遁形，在多方確認無病毒及類病毒後進入繁殖系統，提供種苗無病原的品質確認。
聯絡資訊
單位(或姓名)：行政農業委員會種苗改良繁殖場 邱燕欣助理研究員
電話：04-25825471/04-25825432
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