鑑定邊境攔截之陸蓮花微嵌紋病毒 (Ranunculus mild mosaic virus) 及其檢測試劑之製備與應用.pdf
台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 71(1):73–86 (2022) 研究報告
DOI:10.6156/JTAR.202203_71(1).0006
鑑定邊境攔截之
陸蓮花微嵌紋病毒 (Ranunculus mild mosaic virus)
及其檢測試劑之製備與應用
陳金枝1,* 廖家翌2 廖敏伶3 劉逸琪3 江芬蘭2
摘要
陳金枝、廖家翌、廖敏伶、劉逸琪、江芬蘭。2022。鑑定邊境攔截之陸蓮花微嵌紋病毒
(ranunculus mild mosaic virus) 及其檢測試劑之製備與應用。台灣農業研究71(1):73–86。
本研究鑑定進口陸蓮花 (Ranunculus asiaticus) 切花上引起葉片嵌紋徵狀之病毒,病葉樣品為行政院農業委
員會動植物防疫檢疫局新竹分局於輸入檢疫取樣之荷蘭進口陸蓮花。初步以花卉病毒多元抗體進行間接式酵
素連結免疫吸附反應 (indirect enzyme-linked immunosorbent assay; indirect ELISA) 檢測,受測樣品均與potyvirus
單元抗體 (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA) 產生正反應,並能與potyvirus簡併式引子對 [HRP-5/Oligo-dT ] 於
(14)
RT-PCR反應中產生預估大小約1.3 kbp之核酸片段,經選殖與定序鑑定後,乃屬於ranunculus mild mosaic
virus (RanMMV) 之核酸序列,並與GenBank上已登錄之RanMMV (Accession No. LC387972) 之鞘蛋白核苷
酸及胺基酸序列有高達98.6%以上之相同度,屬相同病毒之分離株。於reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR)檢測中,本研究所設計的RanMMV引子對 (RanMM-u/RanMM-d) 均可由葉片呈現嵌紋徵狀
的陸蓮花切花和罹病種球組織檢出1.04 kbp之核酸片段產物。進一步將解得之RanMMV鞘蛋白核酸序列共
825個核苷酸以基因合成法構築於pET28a(+) 表現載體上,再於Escherichia coli BL21宿主中進行鞘蛋白之誘
導 (分子量約30.5 kDa),並將其作為抗原以製備RanMMV之多元抗體,可成功用於進口陸蓮花切花及種球
上對RanMMV之檢測。本研究為首次於邊境截獲國外的陸蓮花病毒RanMMV,國內尚未有此病毒之發生,
本研究成功研製之RanMMV核酸及免疫檢測技術,將可提升對進口陸蓮花之邊境檢疫效能。
關鍵詞:陸蓮花、馬鈴薯Y屬病毒、多元抗體、RT-PCR檢測。
前言 罹染病毒病的陸蓮花,切花品質及產量均
會受影響 (Restuccia et al. 2011)。國際間已記錄
陸蓮花 (Ranunculus asiaticus) 原產於東地
可感染陸蓮花的病毒種類至少15種 (Restuccia
中海地區,16世紀初從土耳其引入西歐;目前
et al. 2011),包括broad bean wilt virus 2 (BBWV-2)
廣泛分布於西歐、南非、北美、以色列和日本
(Turina et al. 2006; Emadzade et al. 2011);由 (Minutolo et al. 2016)、cucumber mosaic virus
於其種類多樣、花型及及花色美麗,為廣被栽 (CMV) (Ushiyama et al. 1989; Hayahi et al. 2018)、
培且深受歡迎的花卉。全球主要產區為荷蘭、 impatiens necrotic spot virus (INSV) (Vaira et
以色列和義大利,以種球無性繁殖 (Beruto et al. 1997; Restuccia et al. 2011)、plum pox virus
al. 2018)。 (PPV) (van Oosten 1970)、potato virus Y (PVY)
投稿日期:2021 年8月25日;接受日期:2021 年11月30日。
* 通訊作者:chinzue@tari.gov.tw
1 農委會農業試驗所植物病理組副研究員。台灣 台中市。
2 農委會農業試驗所植物病理組計畫助理。台灣 台中市。
3 農委會動植物防疫檢疫局新竹分局技正。台灣 桃園市。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 7733 22002222//33//2211 上上午午 1100::1133::556674 台灣農業研究 第71卷 第1期
(Bellardi et al. 1988)、ranunculus leaf distortion (Frenkel et al. 1989; Van Regenmortel et al.
virus (RanLDV) (Turina et al. 2006)、ranunculus 2000)。
mild mosaic virus (RanMMV) (Wang et al. 2008; 台灣主要以進口陸蓮花切花或種球栽培,
Minutolo et al. 2016; Hayahi et al. 2018)、 開花的高峰期為冬季到春季,對於可能隨種球
ranunculus mosaic virus (RanMV) (Turina 進口而輸入國內之病毒種類,有必要建立自主
et al. 2006; Ciuffo et al. 2011)、ranunculus mottle 檢測能力以因應邊境檢疫或監測之需。本研究
virus (RMV) (Laird & Dickson 1967; Elliott 針對行政院農業委員會動植物防疫檢疫局新竹
et al. 1988)、ranunculus white mottle virus 分局 (以下簡稱防檢局新竹分局) 於邊境所攔
(RWMV) (Vaira et al. 1997, 2000)、tomato 截之進口陸蓮花切花和種球所檢出之potyvirus
spotted wilt virus (TSWV) (Lisa et al. 1990; 病毒,進行其分子核酸定序與鑑定,確認其為
Whitfield et al. 2003; Hayahi et al. 2018)、tur- RanMMV;進一步設計其核酸檢測用引子對,
nip mosaic virus (TuMV) (Ohshima et al. 2002; 以及應用細菌生合成系統表現RanMMV病毒
Restuccia et al. 2011)、tobacco necrosis virus 之鞘蛋白作為抗原,成功製備出RanMMV多
(TNV) 和 tobacco rattle virus (TRV) (Restuccia 元抗體供免疫檢測用。本研究所開發之核酸或
et al. 2011)。其中,RanMMV 首次於義大利 免疫檢測試劑,可應用於邊境檢疫之進口陸蓮
的陸蓮花上被發現,引起葉片嵌紋,可經由蚜
花病毒的監測。
蟲傳播,寄主範圍局限於毛茛科 (Ranuncula-
ceae) (Turnia et al. 2006)。在陸蓮花產區中,
材料與方法
RanMMV更是影響陸蓮花生產品質的關鍵病毒
(Restuccia et al. 2011; Hayahi et al. 2018)。 材料來源
RanMMV 為 Potyvirus 屬病毒之成員, 本研究之試驗樣品來源乃由防檢局新竹分
potyvirus病毒型態為長絲狀,病毒顆粒大小約 局於2019–2020年期間於輸入檢疫時取樣之荷
680–900 nm;具有分子量約 30–47 kDa 的蛋 蘭進口 (原產地為義大利) 陸蓮花切花,本試
白質外鞘 (coat protein; CP),其基因體乃由分 驗以葉片出現有嵌紋徵狀 (mosaic) 者以及進
子量大小約9.7 kb的單股正極性RNA (positive 口種球為檢測材料。
sense ssRNA) 所組成。Potyvirus 屬病毒的分
以免疫檢測法初步鑑定病毒
類可由病毒顆粒形態、媒介昆蟲種類、血清親
緣關係和核酸分子特性等方面鑑定之;近年來 由防檢局新竹分局自海關抽樣之陸蓮花
依據國際病毒分類委員會 (International Com- 切花材料,初步以市售之potyvirus 單元抗體
mittee on Taxonomy of Viruses; ICTV) (https:// (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA) 及實驗室之前
talk.ictvonline.org/) 所公布的Potyvirus屬病毒 已製備之TuMV、CMV和TSWV等花卉病毒
分類標準:對於Potyvirus屬病毒的種 (species) 抗體進行間接式酵素連結免疫吸附反應 (in-
分類界定,主要依據 (1) 完整基因體的核苷酸 direct enzyme-linked immunosorbent assay;
(nucleotide; nt) 序列相同度小於 76%、胺基 indirect ELISA) 檢測,篩選與受測之病毒抗體
酸小於82%者為不同種之病毒;(2) 若以特定 產生正反應之陸蓮花切花,進行後續之核酸增
蛋白區域的核苷酸相同度進行比較,於P1對 幅反應及病毒核苷酸定序試驗。
應區域小於58%,而於其他區域小於 74–78%
抗血清免疫檢測分析法
者為不同種;(3) 針對 CP 核苷酸相同度小於
76–77%且胺基酸小於80%者為不同種之病毒 Indirect ELISA法:本試驗參考以往報告
(Adams et al. 2005)。此外,Potyvirus屬病毒 進行之 (Clark & Adams 1977; Chang et al. 1988;
也可依據其 3’ 端非轉譯區 (3’-noncoding re- Chen et al. 2016)。取0.1 gm之受測樣品組織,
gion; 3’-NCR) 之核苷酸序列比對,在高於 以 3 mL之15 mM碳酸鈉緩衝液 (sodium car-
80%相同度者鑑定為相同種的potyvirus病毒 bonate buffer, pH 9.6) 研磨均勻後,加入 96孔
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ELISA反應盤內,每樣品加2孔 (100 μL/孔) 為 核酸純化:取0.1 g之受測組織,加入液
2個重複,置於37℃定溫3–4 h進行覆膜反應 態氮研磨均勻後,依據市售之植物全量核酸萃
(coating reaction),然後以1× PBST緩衝液 (137 取試劑組 (Plant Total RNA mini Kit, Viogene,
mM NaC1, 1.5 mM KH PO , 1 mM Na HPO , Viogene-BioTek Corparation, Taipei, Taiwan)
2 4 2 4
0.05% Tween 20, pH 7.4) 沖洗 3次;之後分別 步驟,進行供試植物組織樣品之全量核醣核酸
加入欲檢測之病毒抗體後,放置在37℃定溫箱 (total RNA) 萃取。
反應2 h;爾後以 1× PBST緩衝液沖洗3次, 單步驟 RT-PCR 法:以純化所得之 RNA
再加入已稀釋6,000×之山羊抗兔二次抗體 (goat 為模板,使用可增幅Potyvirus屬病毒核酸3’
anti-rabbit immunoglobin, Jackson, West Grove, 端 (3’-terminal region) 約1.3 kbp之簡併式引
PA, USA) (100 μL/孔),置於 37℃定溫箱反 子對HRP-5/Oligo-dT (5’ATGATHGARKCNTG-
(14)
應 2 h;最後再以 1× PBST 緩衝液沖洗 4 次
GGG3’/5’GCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTT3’)
後,再以150 μL/孔之比例加入濃度為1 mg mL-1 (Pappu et al. 1998; Chen et al. 2006) 進行單步
之鹼性磷酸酶酵素基質 (p-NPP) (VWR Life Sci-
驟 RT-PCR 反應。反應條件依據市售RT-PCR
ence, Solon, OH, USA) 進行呈色反應。反應30
試 劑 組 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)
min後,以ELISA讀值儀 (PTI max microplate
之配方,於每一25 μL反應液中分別加入1 μL
reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA,
之全量RNA、12.5 μL之2× Reaction Mix、0.5
USA) 讀取波長405 nm下之吸收值,作為評估
μL之SuperScript III RT-/Platinum Taq Mix、
病毒濃度高低之依據。樣品吸光值大於健康葉
各 1 μL 之 10 μM 上游和下游引子和 9 μL 之
片2倍者,判讀為正反應。
DEPC-treated water。所有試劑混合均勻後,
西方墨點法:取0.1 gm受測樣品之組織,
於熱循環反應儀 (Biometra T3000 Thermocy-
置於1.5 mL微量離心管內,加入液態氮研磨均
cler, Germany) 中進行。設定反應程序為:
質,加入200 μL樣品處理液混勻 (Chen et al.
50℃下進行反轉錄 30 min、94℃變性 2 min;
2016),再加入 200 μL 之 LDS (Laemmli dis-
之後進行 30 個 PCR 循環反應:94℃下變性 1
sociation solution) (Laemmli 1970) 溶液混勻,
min、50℃下黏合1 min,72℃下聚合1 min,
於沸水中悶熱3–5 min,以5,900× g離心5 min
最後一個循環之72℃聚合反應延長為6 min。
後取上清液進行電泳分析。樣品經SDS-PAGE
反應結果以1.2%電泳瓊膠 (SeaKem, Agarose,
(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
Cambrex Bio Science Rockland, Inc., Rock-
electrophoresis) 電泳後,取膠體轉漬於PVDF
land, ME, USA) 進行分析判讀結果。
(polyvinylidene fluoride) 膜 (Immobilion-P;
核酸片段選殖和核苷酸序列分析:經由引
Merck Millipore Ltd., Cork, Ireland) 再與受測
之病毒抗體進行反應。 子對 HRP-5/Oligo-dT(14) 於 RT-PCR 反應中所
增幅出預估分子量大小約1.3 kbp的核酸片段,
病毒3’端核酸片段之增幅、選殖與定序
選殖於 pGEM-T Easy Vector Systems 載體上
分析
(Promaga, Madison, WI, USA),篩選出含有此
以本研究受測陸蓮花樣品被 potyvirus 單 特定嵌入序列 (insert sequence) 選殖株送交核
元抗體檢出有反應者,進一步以單步驟反轉錄- 酸定序公司 (明欣生物科技有限公司,台灣台
聚合酶鏈鎖反應法 (reverse transcription-poly- 北市),以自動核酸定序儀分析其核苷酸序列,
merase chain reaction; RT-PCR) 進行其 3’ 端 所得序列以 Vector NTI Suite (InforMax Inc.,
核酸片段之增幅,將符合預估分子量大小的特 WI, USA) 軟體進行分析,並與美國國家生物科
定核酸片段產物做選殖後進行核苷酸定序分 技資訊中心 (National Center for Biotechnology
析,以取得不同病毒分離株之鞘蛋白 (CP) 核 Information; NCBI) 基因資料庫 (GenBank) 已
酸序列。採用之單步驟RT-PCR法反應條件詳 登錄的 Potyvirus 屬病毒之 CP 核苷酸和胺基
述如下。 酸序列進行比對分析。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 7755 22002222//33//2211 上上午午 1100::1133::557776 台灣農業研究 第71卷 第1期
RanMMV 之引子對設計與 RT-PCR 檢 之後,進一步選用已確定有表現 CP 之
測罹病組織 pET-RanMMVCP選殖株進行大量表現蛋白之
誘導與純化 (Li et al. 1998; Chen et al. 2016),
依據從陸蓮花罹病材料所選殖定序完成的
將純化之表現蛋白濃縮為1 mg mL-1以做為抗
RanMMV 分離株 3’ 端之 1.3 kbp 之核苷酸序
原,並送交濁水溪生物科技有限公司 (台灣桃
列設計RT-PCR檢測用專一引子對,上游引子
園市) 進行每週1次、連續4 wk的免疫注射於
RanMMVu (5’ GGACAGTTGACTTGGGAGC-
兔子以製備多元抗體。
TA3’)、下游引子RanMMVd (5’ CTGTGATT-
GAAAGGT GGGTTCC3’),預估可增幅出產 RanMMV-CP 多元抗體對不同馬鈴薯 Y
物分子量大小約1.04 kbp,此片段將可包含全 屬病毒之檢測
長度 RanMMV-CP 及其兩端核苷酸之序列。 為評估自製多元抗體之檢測效果,本試驗
取陸蓮花罹病組織,純化其全量核酸作為模板
以indirect ELISA 法進行測試,選用本研究室
進行單步驟RT-PCR反應。設定反應程序為: 以往保存之15種不同Potyvirus屬病毒之罹病
50℃下進行反轉錄 30 min、94℃變性 2 min; 組織與自製之 RanMMV-CP 多元抗體進行反
之後進行 30 個 PCR 循環反應:94℃下變性 1 應,取 0.1 gm 之受測樣品組織進行之。Indi-
min、52℃下黏合50 s,72℃下聚合1 min,最 rect ELISA 法檢測步驟詳如前述,樣品吸光值
後一個循環之72℃聚合反應延長為6 min。反 大於健康葉片2倍讀值者,判讀為正反應。
應結果以1.2%電泳瓊膠進行分析判讀結果。
RanMMV-CP 多元抗體應用於陸蓮花罹
RanMMV-CP 表現蛋白誘導及多元抗體 病株之檢測
製備
分別取用 2019–2020 年由防檢局新竹分
依據 RanMMV 分離株定序結果,選取其 局於輸入檢疫取樣之陸蓮花切花及種球,採
全長度 CP 核苷酸序列為模板,委託波仕特 取0.1 gm之切花葉片或種球組織,以indirect
生物科技股份有限公司 (台灣台北市) 進行全 ELISA 與自製 RanMMV-CP 多元抗體進行反
長度 RanMMV-CP 核苷酸合成,並構築於表 應,流程詳如前述。另以市售之 potyvirus 單
現載體 pET28a(+) 之質體上 (Novagen Inc., 元抗體之檢測結果比較之,以評估本研究之自
Madison, WI, USA),質體代號為 pET-Ran- 製多元抗體對陸蓮花罹病材料之檢測效果。
MMVCP。所合成之核酸片段,包含有對應全 取用以indirect ELISA檢出正反應之陸蓮
長度 CP 之 825 個核苷酸及 CP 核苷酸終止碼 花樣品,進一步於西方墨點法中與RanMMV-
(TAG)、2種限制酶切位 (分別為5’端之NcoI CP多元抗體進行反應,以評估於西方墨點法
和3’端之XhoI切位)。 檢測陸蓮花罹病材料之效果。
將 pET-RanMMVCP 質 體 轉 型 於 Esche-
richia coli BL21宿主內,進行RanMMV-CP之 結果
表現蛋白誘導與純化,相關試驗方法參照以往
邊境攔截之感染陸蓮花切花的病毒初步
研究報告進行 (Chen et al. 2018):轉型株以M9
鑑定
培養基培養,並以1 mg mL-1之IPTG (isopro-
pyl-β-D-thiogalactopyranoside) 誘導蛋白質之表 Indirect ELISA法:本試驗以indirect ELISA
現 (Li et al. 1998)。培養之菌液以 5,900× g轉 法檢測2019年首次由防檢局新竹分局於輸入
速離心10 min後,沉澱物以0.5 M Tris-EDTA 檢疫抽樣之陸蓮花切花材料,受測21個樣品
(pH 8.0) 緩衝液溶解均勻,並進行SDS-PAGE 均呈現嵌紋徵狀 (圖 1) 且僅與市售之 potyvi-
電泳分析,再經西方墨點法以市售potyvirus rus 單元抗體產生正反應 (表 1),顯示此等切
單元抗體 (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA) 確認 花樣品內存在與potyvirus有血清類緣相近的
RanMMV-CP抗原之表現。 病毒。進一步將切花樣品分為花朵、葉片和花
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 7766 22002222//33//2211 上上午午 1100::1133::5577陸蓮花RanMMV鑑定及檢測 77
表1. 以間接式酵素連結免疫吸附法檢測進口陸蓮
花切花各部位組織之病毒分布。
Table 1. Detection of potyvirus on the different
portions of ranunculus cut flowers by indirect en-
zyme-linked immunosorbent assay.
ELISA reading (A )y
405nm
Samplez Flower Leaf Peduncle
1 0.340 0.140 1.981
2 1.096 0.367 3.174
3 0.589 0.104 2.205
4 0.951 0.210 1.041
5 2.235 0.293 0.828
6 0.352 0.168 1.912
7 0.399 0.133 1.187
8 0.158 0.110 0.255
9 0.464 0.245 2.556
10 0.166 0.106 0.619
11 1.336 0.227 2.461
12 1.355 0.177 1.305
圖1. 邊境攔截之進口陸蓮花切花呈現葉片嵌紋
13 0.345 0.158 2.163
病徵,檢出有陸蓮花微嵌紋病毒 (ranunculus mild
mosaic virus; RanMMV)。 14 0.220 0.069 0.338
Fig. 1. Mosaic symptoms on leaves of the border-in- 15 0.342 0.102 0.631
tercepted ranunculus cut flowers positively detected 16 1.443 0.107 0.952
with ranunculus mild mosaic virus (RanMMV).
17 0.535 0.094 1.103
18 0.122 0.085 0.333
莖 3 個部位與 potyvirus 單元抗體反應,結果
19 0.507 0.110 1.758
顯示此 21 個樣本檢出的 potyvirus 病毒呈現
20 0.131 1.013 2.655
不均勻分布 (表1),在花莖部位可全數檢出, 21 0.157 0.410 2.201
ELISA正反應平均讀值1.508;於花朵部位也 D-CK 3.413 3.413 3.413
是全數檢出,正反應平均讀值0.630;於葉片 2H-CK 0.110 0.110 0.110
部位的檢出數最少,為12個,正反應平均讀 No. positive 21 12 21
值0.295,以上結果顯示採樣花莖為檢測材料, Av. positive value 0.630 0.295 1.508
可獲得較高的病毒檢出數與讀值。 z Tested samples are cut fl owers collected from imported Ra-
nunculus in 2019.
RT-PCR法及3’端核酸片段定序分析:將 y The absorbance values were an average of two replicate
與 potyvirus單元抗體有正反應之陸蓮花切花 wells. Samples with enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) readings lower than twofold healthy control (2H-CK)
組織樣品,進一步以potyvirus 簡併式引子對 were considered undetectable by indirect ELISA. Positive
HRP-5/Oligo-dT 以 RT-PCR 增幅其 3’ 端核 control (D-CK) is the bacterial expressed coat protein of a
(14) potyvirus. The monoclonal antibody of potyvirus (Agdia Inc.,
酸片段,均可產生與預估分子量約1.3 kbp大 Elkhart, IN, USA) was used for detection.
小的核酸片段 (圖2A),將此等增幅產物做選
殖於 pGEM-T 載體並進行核苷酸定序分析, 辨識位置均為VFHQ/A (圖3),與 GenBank上
所選殖到的4個分離株 (RanMMV 1、2、3、4) 已登錄之RanMMV (Accession No. LC387972)
之核酸片段,均具有potyvirus 3’端的特性, 相同;CP 核苷酸和胺基酸之相同度均與 Ran-
即含有poly(A) 尾端,且CP核苷酸長度均為 MMV (Accession No. LC387972) 達98.6%以上
825 nts;且nuclear inclusion b (NIb) 和 CP之 (表2、圖3),而 3’-NCR核苷酸序列相同度也
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(A) 表2. 邊境攔截之陸蓮花微嵌紋病毒ranunculus
mild mosaic virus (RanMMV) 分離株與已登錄於
GenBank之其他Potyvirus病毒鞘蛋白基因序列分析
比對。
Table 2. Percent identities of the nucleotide and ami-
no acid sequences of the coat protein region of ranun-
culus mild mosaic virus (RanMMV) isolates to other
ranunculus potyviruses available in GenBank.
(B) Percent identity ofy
Virus isolatez CP-nt CP-aa 3’-NCR
RanMMV (LC387972) 100.0 100.0 100.0
RanMMV (EU684747) 99.8 99.6 99.5
RanMMV 1 99.8 99.6 100.0
RanMMV 2 99.4 98.6 100.0
RanMMV 3 99.4 99.3 100.0
圖2. 罹染陸蓮花微嵌紋病毒 (ranunculus mild
mosaic virus; RanMMV) 之陸蓮花組織的反轉錄-聚 RanMMV 4 99.5 99.6 99.5
合酶鏈鎖反應電泳圖。分別以 (A) potyvirus簡併式 RanMV (DQ152192) 60.7 56.4 44.2
引子對和 (B) RanMMV專一性引子對進行之。行M: z The sequences of various Ranunculus potyvirus coat protein
核酸分子量標幟;行1–7:陸蓮花RanMMV罹病葉 genes used in this study were obtained from GenBank, in-
cluding ranunculus mild mosaic virus (RanMMV) (Accession
組織;行H:健康陸蓮花葉組織;行D:RanMMV No. LC387972 & EU684747) and ranunculus mosaic virus
罹病組織正對照。 (RanMV) (Accession No. DQ152192). Sequences of Ran-
MMV 1–4 were molecularly cloned in this study.
Fig. 2. Agarose gel electrophoresis of DNA products y Sequences analysis was conducted using of the program of
amplifi ed from reverse-transcription polymerase chain
Vector NTI Suite (InforMax Inc., WI, USA).
reaction (RT-PCR) of the ranunculus mild mosaic virus
(RanMMV) isolate by (A) the primer pairs of poty-
virus-degenerate primers and (B) RanMMV specific 由陸蓮花切花組織 (圖2B) 和種球組織 (圖4),
primers, respectively. Lane M: molecular marker; lanes
1–7: RanMMV-infected tissues; lane H: the healthy 獲得預估分子量大小約1.04 kbp的核酸片段產
control; lane D: the positive control of RanMMV. The 物;且核苷酸定序結果,確屬RanMMV之序
predict amplicons of A and B were 1.3 kbp and 1.04
kbp, respectively. 列 (結果未出示)。由21個進口種球中,檢出
7個帶有RanMMV,檢出率約 33.3%。本結果
顯示,所設計的引子對可成功應用於陸蓮花組
高達99.5%以上 (表2);但與感染陸蓮花之另 織的檢測,尤其是對於進口種球僅採樣其組織
一種potyvirus (ranunculus mosaic virus; RanMV) 仍可檢出此病毒。
(Accession No. DQ152192; Turina et al. 2006),
陸蓮花RanMMV-CP多元抗體之製備與
CP核苷酸和胺基酸之相同度分別為60.7%及
檢測效果
56.4%,3’-NCR核苷酸序列相同度則僅為44.2%
(表 2)。依據 Potyvirus 屬病毒胺基酸序列特 本研究於 E. coli 細菌宿主內誘導之陸蓮
性 (Ward et al. 1992; Adams et al. 2005),歸 花RanMMV-CP表現蛋白,為預估包含有對應
納本研究所解得之陸蓮花病毒核酸序列,均為 全長度CP之275個胺基酸的融合性蛋白 [CP
Potyvirus屬之RanMMV。 的 N 端外加有表現載體 pET28a(+) 的 1 個胺
基酸],於SDS-PAGE的電泳分析中可見融合
以自行設計之 RanMMV 引子對和 RT-
性表現蛋白之分子量約為 30.5 kDa,與預估值
PCR檢測罹病組織
相符,而不含有 RanMMV-CP 核酸的表現載
本研究依據 RanMMV 分離株的 3’ 端 1.3 體pET28a(+) 未偵測到此對應條帶 (圖5A)。
kbp 之核苷酸序列所設計的 RanMMVu/Ran- 於西方墨點法中,市售 Potyvirus屬病毒的單
MMVd 引子對,於 RT-PCR 反應中,分別可 元抗體可與 RanMMV-CP 表現蛋白產生正反
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 7788 22002222//33//2211 上上午午 1100::1133::5588陸蓮花RanMMV鑑定及檢測 79
圖3. 不同陸蓮花微嵌紋病毒 (ranunculus mild mosaic virus; RanMMV) 分離株之鞘蛋白胺基酸序列比對。
Fig. 3. Alignment of the amino acid sequences of different ranunculus mild mosaic virus (RanMMV) isolates.
RanMMV 1, 2, 3, and 4 were collected from the imported cut fl owers of Ranunculus asiaticus; The RanMMV isolate
(LC387972) is available in GenBank was used for comparison.
應 (圖 5B),顯示本研究之 RanMMV-CP 表現 以indirect ELISA法評估RanMMV-CP多
蛋白具有 Potyvirus病毒之抗原特性。以表現 元抗體檢測陸蓮花罹病組織和其他來源的po-
蛋白為抗原所製備之RanMMV-CP多元抗體, tyvirus 受測樣品的效果上,RanMMV-CP 多
可與其同源的 RanMMV-CP 表現蛋白產生正 元抗體對於其細菌表現之鞘蛋白同源抗原 (D-
反應 (圖5C)。 CK) 及 RanMMV 罹病組織均具有高於1.5 的
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 7799 22002222//33//2211 上上午午 1100::1144::001180 台灣農業研究 第71卷 第1期
(A) (A)
(B)
(B)
圖4. 以陸蓮花微嵌紋病毒 (ranunculus mild mosaic
virus; RanMMV) 專一引子對進行陸蓮花種球組織之
反轉錄-聚合酶鏈鎖反應的電泳圖;(A) 陸蓮花種球
和 (B) 電泳圖。罹染RanMMV者可檢出1.04 kbp.
之核酸片段產物。行M:核酸分子量標幟;行1–5:
進口陸蓮花種球;行H:健康陸蓮花葉組織;行D:
RanMMV罹病組織正對照。
Fig. 4. Agarose gel electrophoresis of DNA products of
ranunculus mild mosaic virus (RanMMV) amplifi ed from
(C)
ranunculus bulbs in reverse-transcription polymerase
chain reaction (RT-PCR) with the RanMMV specific
primers. (A) The picture showed ranunculus bulbs and
(B) RT-PCR amplicons; The 1.04-kbp amplicons were
detected from those RanMMV-infected bulbs. Lane M:
molecular marker; lanes 1–5: ranunculus bulbs; lane H:
the healthy control; lane D: the positive control of Ran-
MMV; The predict amplicons was 1.04 kbp.
正反應讀值 (表 3),與其他受測的 potyvirus 圖5. 應用細菌大量表現的陸蓮花微嵌紋病毒
罹病組織反應結果僅與 gomphocarpus mosaic (ranunculus mild mosaic virus; RanMMV) 分離株融
合性表現蛋白之SDS-PAGE及西方墨點法分析。
virus (GoMV)、TuMV-YC5、bean common
(A) RanMMV融合性表現蛋白 (30.5 kDa) 之SDS-
mosaic virus (BCMV)-BlCM、zucchini yellow
PAGE蛋白質電泳圖。受測樣品分別與 (B) Agdia公
mosaic virus (ZYMV) 和 papaya ringspot virus 司出品之potyvirus單元抗體和 (C) 自製之RanMMV
(PRSV) 有正反應,且讀值僅介於 0.3–0.7 之 多元抗體進行西方墨點法分析。行M:蛋白質分
間,顯示 RanMMV-CP 多元抗體雖對其他的 子量標幟;行pET:未帶有病毒鞘蛋白之細菌載體
potyvirus 也具有檢測效力,但仍以與同源之 pET28a(+);行BEP:細菌表現之病毒鞘蛋白;行
eBEP:純化後之細菌表現的病毒鞘蛋白。
RanMMV反應值較高 (表3)。
Fig. 5. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
RanMMV-CP多元抗體與防檢局於2019–
electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting
2020 年期間由輸入檢疫取樣的陸蓮花葉片嵌 assays of the bacterial-expressed coat protein (CP) of
ranunculus mild mosaic virus (RanMMV). (A) A 30.5-
紋罹病材料或種球組織的讀值均為正反應值,
kDa bacterial-expressed fusion protein of RanMMV-CP
介於 0.86–3.01 間 (表 4),且其對檢出有病毒 was observed in the SDS-PAGE assay. The tested sam-
ples were reacted with (B) the purchased monoclonal
的正反應樣品數,與市售的potyvirus 抗血清
antibody of potyvirus (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA),
所檢出者相同 (表4);進一步以西方墨點法檢 and (C) the polyclonal antibody of RanMMV-CP pre-
測發現此多元抗體也可與陸蓮花RanMMV罹 pared in this study. Lane M: protein markers; lane pET:
IPTG-induced bacterial cell lysate containing the ex-
病樣品產生正反應條帶 (圖6)。 pression vector pET28a(+) without RanMMV-CP insert;
由上述結果顯示自製之RanMMV-CP多元 lane BEP: IPTG-induced bacterial cell lysate containing
pET28a(+) with RanMMV-CP insert; lane eBEP: the
抗體於上述兩種免疫檢測法中,皆可成功檢測 purifi ed bacterial-expressed RanMMV-CP.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 8800 22002222//33//2211 上上午午 1100::1144::0022陸蓮花RanMMV鑑定及檢測 81
表3. 利用細菌表現之陸蓮花微嵌紋病毒ranunculus mild mosaic virus (RanMMV) 融合性鞘蛋白所製備的多
元抗體於間接式酵素連結免疫吸附法檢測不同Potyvirus病毒之效果。
Table 3. Detection efficiency of the polyclonal antibodies produced with bacterial expressed fusion coat protein of
ranunculus mild mosaic virus (RanMMV) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay.
ELISA reading (A )y
405nm
Samplez Agdia-Potyvirus Anti-RanMMVCP
Ranunculus mild mosaic virus (RanMMV)
RanMMV 1 1.425 1.630
RanMMV 2 2.389 2.496
RanMMV 3 1.501 2.095
RanMMV 4 2.384 2.090
gomphocarpus mosaic virus (GoMV) 0.838 0.682
turnip mosaic virus (TuMV)-YC5 0.853 0.465
East Asian passiflora virus (EAPV) 1.098 0.098
telosma mosaic virus (TeMV) 1.292 0.110
soybean mosaic virus (SMV) 0.084 0.128
potato virus Y (PVY)-potato 0.075 0.117
bean yellow mosaic virus (BYMV) 0.351 0.131
bean common mosaic virus (BCMV)-BlCM 2.718 0.621
gloriosa stripe mosaic virus (GSMV) 0.125 0.188
lily mottle virus (LMoV) 0.923 0.172
zantedeschia mild mosaic virus (ZaMMV) 1.535 0.258
zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) 1.869 0.348
ornithogalum mosaic virus (OrMV) 0.826 0.153
papaya ringspot virus (PRSV) 2.514 0.403
lycoris potyvirus 0.132 0.244
D-CK 2.292 2.284
2H-CK 0.098 0.112
z Tested potyviruses are preserved diseased materials in the laboratory.
y The absorbance values were an average of two replicate wells. Samples with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) read-
ings lower than twofold healthy control (2H-CK) were considered undetectable. Positive control (D-CK) is the bacterial expressed
viral protein. The monoclonal antibody of potyvirus (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA) was used for comparison.
到同源抗原 RanMMV,也可應用於陸蓮花上 對此病毒鞘蛋白進行多元抗體之製備與應用,
對相同病毒的檢測。 成功建立RanMMV的檢測技術,用於強化對
此病毒的邊境監測。
討論 國際間的陸蓮花栽培產區普遍發生有
RanMMV,台灣目前尚未有此花卉的商業產
本研究以核酸分子生物技術和血清學方法
區,僅由業者零星由國外進口切花或少量種球
鑑定由邊境輸入檢疫取樣之進口陸蓮花切花與 栽種。惟透過花卉材料之進口,有容易將國外
種球,首次成功鑑定其帶有屬於馬鈴薯Y屬病 已發生的病毒引入國內的風險,極需建立可靠
毒 (Potyvirus) 成員的RanMMV,而此病毒目 的檢測技術,用於強化病毒的邊境監測。採用
前在台灣並未有發生紀錄,為邊境檢疫攔截到 病毒核酸檢測及序列比對做鑑定,可獲得較穩
的病毒。本研究利用所攔截之罹病材料,進行 定而正確的病毒檢測結果 (Ward et al. 1992;
RanMMV 核酸檢測用引子對之設計,以及針 Adams 2005; Gibbs & Ohshima 2010),尤其針
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 8811 22002222//33//2211 上上午午 1100::1144::002282 台灣農業研究 第71卷 第1期
表4. 利用細菌表現之陸蓮花微嵌紋病毒ranunculus
mild mosaic virus (RanMMV)鞘蛋白所製備的多元抗
體於間接式酵素連結免疫吸附法檢測邊境攔截之陸
蓮花罹病組織之效果。
Table 4. Detection of the border-intercepted ranun-
culus samples with polyclonal antibodies produced
with bacterial expressed fusion coat protein of ranun-
culus mild mosaic virus (RanMMV) in indirect en- 圖6. 利用細菌表現之陸蓮花微嵌紋病毒
zyme-linked immunosorbent assay. (ranunculus mild mosaic virus; RanMMV) 抗血清於西
ELISA reading (A )y 方墨點法檢測陸蓮花罹病組織。行M:蛋白質分子
405nm
Samplez Anti-potyvirusx Anti-RanMMVCP 量標幟;行R1–R7:罹染RanMMV之陸蓮花組織;
行BEP:細菌表現之RanMMV鞘蛋白;行H:健
108-1 2.770 2.698
康陸蓮花組織。
108-2 3.114 2.784
Fig. 6. Western blotting test of antiserum against bac-
108-3 2.697 2.499
terial expressed coat protein of ranunculus mild mosaic
108-4 1.953 2.056 virus (RanMMV) and the virus-infected ranunculus tis-
108-5 2.643 2.698 sues imported from Netherland. Samples were reacted
to the 1,000×-diluted antiserum against RanMMV. Lane
108-6 2.475 2.333
M: protein marker; lanes R1–R7: virus-infected ranun-
108-7 2.860 2.709 culus tissues; lane BEP: the lysate of bacteria expressed
108-8 0.775 1.255 RanMMV-CP; lane H: healthy tissue of ranunculus.
108-9 3.176 2.865
108-10 1.648 2.075 對邊境檢疫或是新入侵病毒,可快速進行分子
108-11 3.335 3.013 鑑定以掌握病毒對象,並能及時處理境外移入
108-12 2.970 2.804 的病毒,若再搭配免疫檢測分析,則可處理大
108-13 0.949 1.405
量監測樣品的需求。本研究首次針對 2019年
108-14 0.703 1.548
防檢局新竹分局由邊境輸入檢疫取樣的陸蓮花
108-15 2.488 2.402
切花材料攔截到境外花卉病毒,初步以市售的
108-16 1.720 1.958
potyvirus單元抗體及其他國外報導感染陸蓮花
108-17 2.537 2.438
的病毒抗體 (包括 CMV、TuMV 和 TSWV),
108-18 0.589 0.860
108-19 2.670 2.594 在葉片出現嵌紋徵狀的陸蓮花切花以 indirect
108-20 3.006 2.795 ELISA 法篩檢到 potyvirus,進一步以 potyvi-
108-21 2.612 2.546 rus簡併式引子對HRP-5/Oligo-dT 進行RT-
(14)
109-1 3.003 2.022 PCR增幅,由選殖到的病毒3’端約1.3 kbp核
109-2 1.957 2.654 酸片段定序結果顯示所選殖到的病毒CP核苷
109-3 3.312 1.163
酸和胺基酸、3’-NCR核苷酸等序列與已知的
109-4 1.374 2.517
RanMMV有高於98.6%以上的相同度 (表2、
109-5 3.134 2.113
圖 3),此分子鑑定結果顯示所攔截到的陸蓮
109-6 1.605 1.982
花樣品上帶有馬鈴薯Y屬成員RanMMV;後
D-CK 3.595 3.210
2H-CK 0.060 0.101 續依據所獲得之RanMMV-CP序列進行細菌表
z Tested samples are collected from imported cut fl owers (108- 現,以融合性蛋白為抗原,所製備成的多元抗
1–108-21) and bulbs (109-1–109-6) of ranunculus in 2019 體也能與罹病樣品產生正反應,此更證實陸蓮
and 2020.
y The absorbance values were an average of two replicate wells. 花罹染有RanMMV,此外,陸蓮花葉片出現的
Samples with Samples with enzyme-linked immunosorbent as- 嵌紋徵狀也與國外報導之RanMMV引致之病
say (ELISA) readings lower than twofold healthy control (2H-
CK) were considered undetectable. Positive control (D-CK) is 徵相符 (Wang et al. 2008; Hayahi et al. 2018)。
the bacterial expressed coat protein of RanMMV. 血清學為鑑定 Potyvirus 屬病毒的分類方
x The monoclonal antibody of potyvirus (Agdia Inc., Elkhart,
IN, USA) was tested for comparison. 法之一 (Moghal & Francki 1976),惟病毒多
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 8822 22002222//33//2211 上上午午 1100::1144::0033陸蓮花RanMMV鑑定及檢測 83
元抗體於血清反應中容易有非專一性的結果 and E. Dhooghe. 2018. Ranunculus. p.649–671. in:
Ornamental Crops. Vol. 11. (Van Huylenbroeck, J.
(Shepard et al. 1974; Shukla et al. 1989; Jor-
ed.) Springer. Cham, Switzerland. 887 pp.
dan & Hammond 1991; Souiri et al. 2014),也
Chang, C. A., E. Hiebert, and D. E. Purcifull. 1988. Puri-
因此提供了廣效性檢測不同病毒的可能性。本
fication, characterization, and immunological anal-
研究參照所選殖的RanMMV-CP核苷酸序列, ysis of nuclear inclusions induced by bean yellow
構築於表現載體pET28a(+),於 E. coli生合成 mosaic and clover yellow vein potyvirus. Phytopa-
thology 78:1266–1275. doi:10.1094/Phyto-78-1266
系統誘導產生的融合蛋白顯示帶有RanMMV的
Chen, C. C., H. T. Hsu, Y. H. Cheng, C. H. Huang, J. Y.
抗原特性 (圖5),以此表現蛋白為抗原製備完 Liao, H. T. Tsai, and C. A. Chang. 2006. Molecular
成的多元抗體,可應用於indirect ELISA和西 and serological characterization of a distinct potyvi-
方墨點法等免疫檢測法檢測RanMMV (表3、 rus causing latent infection in calla lilies. Bot. Stud.
47:369–378.
表4、圖6),除針對同源病毒的檢體外,也與
Chen, C. C., C. A. Chang, and F. L. Chiang. 2016. Sero-
GoMV、TuMV-YC5、BCMV-BlCM、ZYMV logical and molecular identification of Nerine latent
和 PRSV 等 Potvirus 罹病組織有介於 0.3–0.7 virus infecting blood lily (Haemanthus multiflo-
的正反應讀值 (表3),顯示 RanMMV-CP多元 rus Martyn). J. Taiwan. Agric. Res. 65:194–206.
doi:10.6156/JTAR/2016.06502.09 (in Chinese with
抗體對其他potyvius亦具有廣效性檢測效力, English abstract)
但仍以對同源的RanMMV有較高的檢測讀值 Chen, C. C., F. L. Chiang, and C. H. Huang. 2018. Molec-
(表3)。 ular and serological identification of Gloriosa stripe
mosaic virus on Christmas bells (Sandersonia au-
RanMMV在陸蓮花切花上的分布,依in-
rantiaca Hook). J. Taiwan Agric. Res. 67:229–246.
direct ELSIA法檢測花莖可獲得最高的病毒檢 doi:10.6156/JTAR.201809_67(3).0001 (in Chinese
出率及 ELISA 讀值,高於花朵和葉片之檢測 with English abstract)
結果 (表 1),此結果顯示 RanMMV 在陸蓮花 Ciuffo, M., M. Testa, R. Lenzi, and M. Turina. 2011. Ra-
nunculus latent virus: A strain of Artichoke latent
上的分布不均,因此取花莖樣本進行病毒檢測
virus or a new macluravirus infecting artichoke?
可獲得較高的準確度。陸蓮花以種球分芽球繁
Archi. Virol. 156:1053–1057. doi:10.1007/s00705-
殖,直接採取陸蓮花種球組織進行檢測,也可 011-0949-4
檢出病毒 (表4、圖4),因此對於進口種球的 Clark, M. F. and A. N. Adams. 1977. Characteristics of
the microplate method of enzyme-linked immuno-
病毒監測,可先行取樣種球組織以檢測病毒確
sorbent assay for the detection of plant viruses. J.
保種球的健康度,此將可避免病毒隨種球進口
Gen. Virol. 34:475–485. doi:10.1099/0022-1317-
而傳入國內,也可預防病毒隨種球無性繁殖而 34-3-475
大量散布之風險。 Elliott, M. S., F. W. Zettler, M. Gallegati, and N. J. Ko.
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本研究所製備之陸蓮花病毒核酸檢測用引
Acta Hort. 234:39–43. doi:10.17660/ActaHor-
子對及其多元抗體,均能有效地檢測到 Ran- tic.1988.234.3
MMV病毒,此系統之建立將可強化對陸蓮花 Emadzade, K., B. Gehrke, H. Peter Linder, and E.
進口材料邊境檢疫之自主檢測效能。 Hörandl. 2011. The biogeographical history of
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Identification of Ranunculus Mild Mosaic Virus on
Ranunculus asiaticus Collected from Border Intercepted
Ranunculus and the Development and Application of
the Virus Detection Reagents
Chin-Chih Chen1,*, Jia-Yi Liao2, Ming-Ling Liao3, Yu-Chi Liu3, and Fen-Lang Chiang2
Abstract
Chen, C. C., J. Y. Liao, M. L. Liao, Y. C. Liu, and F. L. Chiang. 2022. Identification of
ranunculus mild mosaic virus on Ranunculus asiaticus collected from border intercepted
ranunculus and the development and application of the virus detection reagents. J. Taiwan
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Ranunculus asiaticus cut flowers with mosaic symptoms imported from The Netherlands were
intercepted by quarantine at the border customs. The potential causal agents were identified and the
detection tools were developed in this study. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (indirect
ELISA) was performed with various antibodies against different ornamental viruses preserved in the
laboratory. All the tested samples were positively reacted with the commercial potyvirus monoclo-
nal antibody (produced by Agdia Inc., Elkhart, IN, USA) and could be positively detected with the
potyvirus-degenerated primers (HRP-5/Oligo-dT to amplify a 1.3-kbp amplicon in reverse tran-
(14)
scription-polymerase chain reactions (RT-PCRs). Sequencing data showed the nucleic acid sequences
of the amplified amplicons were similar to that of ranunculus mild mosaic virus (RanMMV). Both
of the nucleotide and deduced amino acid sequences of the cloned cDNA shared more than 98.6%
identities with that of RanMMV coat protein gene (GenBank Accession No. LC387972) indicating
the intercepted virus is a RanMMV isolate. The further designed RanMMV primer pair (RanMM-u/
RanMM-d) can effectively detect the RanMMV on imported mosaic cut flowers and bulb tissues of
R. asiaticus, and generate a predicted 1.04 kbp amplicon. The cDNA of the RanMMV coat protein
open reading frame (CP ORF), containing 825 nucleotides, was constructed in the expression vector
of pET28a(+) by artificial gene synthesis, and then the fusion protein (approximately Mt. 30.5 kDa)
was expressed in the Escherichia coli BL21 host. The resulting RanMMV coat protein was used as
an antigen to prepare a polyclonal antibody against RanMMV. The produced polyclonal antibody
against RanMMV can successfully detect RanMMV on the imported R. asiaticus in immunoassays.
RanMMV has not been found in Taiwan and this is the first interception case of the virus at the bor-
der. The detection reagents of RanMMV have been successfully developed in this study which might
be helpful in improving the efficiency of border quarantine and inspection on imported Ranunculus
materials.
Key words: Ranunculus asiaticus, Potyvirus, Polyclonal antibody, RT-PCR detection.
Received: August 25, 2021; Accepted: Novmber 30, 2021.
* Corresponding author, e-mail: chinzue@tari.gov.tw
1 Associated Research Fellow, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
2 Project Assistants, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
3 Technical Specialists, Hsinchu Branch, Bureau of Animal and Plant Healthy Inspection and Quarantine, Taoyuan, Taiwan, ROC.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0066 陳陳金金枝枝..iinndddd 8866 22002222//33//2211 上上午午 1100::1144::0033
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