台灣葡萄晚腐病發生調查及其主要病原 Colletotrichum viniferum 之病原性與親緣關係.pdf - 農業知識入口網

b"台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 71(2):135–157 (2022) 研究報告
DOI:10.6156/JTAR.202206_71(2).0004
台灣葡萄晚腐病發生調查及其主要病原
Colletotrichum viniferum 之病原性與親緣關係
林筑蘋1,*　王智立2,3　蔡志濃4　戴裕綸5　安寶貞6　詹月梅7　黃順源8
摘要
林筑蘋、王智立、蔡志濃、戴裕綸、安寶貞、詹月梅、黃順源。2022。台灣葡萄晚腐
病發生調查及其主要病原Colletotrichum viniferum之病原性與親緣關係。台灣農業研究
71(2):135–157。
由Colletotrichum spp.引起之葡萄晚腐病 (grape ripe rot) 為影響台灣葡萄產業最重要的病害之一，為更
瞭解引發台灣葡萄晚腐病之病原菌的主要種類、親緣關係、病徵及田間感染分布狀況，本研究自2012–2020
年間於葡萄主要產區採集呈現典型葡萄晚腐病徵之葡萄果實、具壞疽病斑之枝條或葉片，藉由組織分離得
Colletotrichum spp.分離株共40株。利用internal transcribed spacer (ITS)、lyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase
(GAPDH)、actin (ACT)、beta-tubulin 2 (TUB2) 以及chitin synthase 1 (CHS-1) 等5個基因建立多重序列親緣
關係樹，結果顯示自罹病果實分離之28個分離株主要為Colletotrichum viniferum，並可分成兩個次支序群
(subclade)，屬於次支序群T菌株分離比例高達85.7%，屬於次支序群C的菌株僅占3.6%；其他菌株分別為
Colletotrichum fructicola (7.1%) 及Colletotrichum tropicale (3.6%)。C. viniferum次支序群T菌株分布範圍包括
苗栗縣卓蘭鎮、台中市新社區與霧峰區、彰化縣大村鄉以及南投縣信義鄉、國姓鄉、水里鄉與埔里鎮等葡
萄主要產地；調查結果也顯示可自田間罹病葉片上分離到C. viniferum。田間葡萄幼果接種試驗結果顯示C.
viniferum次支序群T之菌株可自幼果期潛伏感染果實，並於果實轉色初期至成熟時產生典型晚腐病徵；溫室
葡萄盆栽接種試驗證明C. viniferum次支序群T之菌株可引起葉片壞疽，病徵多自葉緣一端開始發展，葉片
壞疽周圍常伴隨大範圍黃暈，嚴重時造成落葉，部分菌株可引起葉脈褐化。此外，藉人工接種試驗亦觀察到
葡萄卷鬚壞疽與花穗壞疽等病徵。從田間調查與病原性試驗結果可確認C. viniferum次支序群T之菌株可於
葡萄果實、葉片、卷鬚與花穗等組織造成多型態的病徵。
關鍵詞：次支序群、葉部病徵、多基因序列親緣關係、葡萄晚腐病、Colletotrichum viniferum。
前言 出現在果實，造成果粒軟腐、裂果與流汁，病
斑處產生橘色到橘紅色分生孢子堆，乾燥環境
葡萄晚腐病 (grape ripe rot) 為台灣最嚴重 下罹病果呈現乾癟狀態；一般認為葡萄晚腐病
之葡萄病害，對產量影響甚鉅，為葡萄產業化 菌較少感染葉片，但會在葉片上行有限的腐生
生產主要限制因子之一。本病常見的病徵主要 繁殖 (Kuo & Hseu 2003; Ko 2008)。
投稿日期：2021 年9月3日；接受日期：2022 年1月27日。
* 通訊作者：cplin@tari.gov.tw
1 農委會農業試驗所植物病理組助理研究員。台灣 台中市。
2 國立中興大學植物病理學系副教授。台灣 台中市。
3 國立中興大學植物醫學暨安全農業碩士學位學程副教授兼主任。台灣 台中市。
4 農委會農業試驗所植物病理組研究員。台灣 台中市。
5 農委會農業試驗所植物病理組計畫助理。台灣 台中市。
6 農委會農業試驗所植物病理組前研究員兼組長。台灣 台中市。
7 農委會農業試驗所植物病理組臨時人員。台灣 台中市。
8 內政部役政署替代役。台灣 南投縣。
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早期真菌鑑定主要根據菌株形態，因此台 seae、C. viniferum、Colletotrichum spp.，以及
灣葡萄晚腐病一直被認為是由 Colletotrichum 另外一群與C. viniferum親緣關係相當接近之
gloeosporioides Penz.引起 (Kuo & Hseu 2003; 支序群V (clade V)族群 (Yokosawa et al. 2017,
Ko 2008; Tzean et al. 2019)。然而，近年的分 2020)。
子親緣研究顯示即便是同一種Colletotrichum， 雖然在各地區引發葡萄晚腐病的主要病
分離株間仍存在許多遺傳差異，無法以形態特 原菌種類不一，C. viniferum或親緣相近之族
徵進行區分，如菌落型態容易隨著培養條件以 群普遍存在於亞洲的中國、韓國和日本，以
及菌株培養時間改變，難以作為鑑定依據。此 及南美洲的巴西等地 (Peng et al. 2013; Lei et
外，由於單一基因在炭疽病菌屬內歧異度有 al. 2016; Oo & Oh 2017; Echeverrigaray et al.
限，無法作為 Colletotrichum sp. 菌株鑑定依 2020; Yokosawa et al. 2020)，並為中國與巴西
據，須結合多基因做多重序列親緣關係分析 多數葡萄產區主要的葡萄晚腐病菌，且較其他
(multi-gene phylogeneic analysis) 方可將菌種 Colletotrchum spp. 對葡萄果實具更高的病原
做出較詳盡的劃分 (Cai et al. 2009; Prihastuti 性 (Yan et al. 2015; Lei et al. 2016; Echeverri-
et al. 2009; Weir et al. 2012)。藉由多重序列親 garay et al. 2020)；而於日本的研究指出，境
緣關係分析，以往鑑定為 C. gloeosporioides 內除有少數C. viniferum菌株外，主要以與C.
的菌株其實可再分類成多個種，因此將之稱為 viniferum 親緣關係相當接近卻又在親緣關係
『C. gloeosporioides 複合種』 (C. gloeospori- 上具差異的支分群V (clade V) 的分離株，其
oides species complex) 或『廣義 C. gloeospo- 同樣具備高致病力，為區域內主要的病原菌族
rioides』 (C. gloeosporioides sensu lato 或 C. 群 (Yokosawa et al. 2020)，在此稱為『日本支
gloeosporioides s.l.) (Rojas et al. 2010; Weir 序群V』。
et al. 2012)。 在台灣，C. viniferum與Colletotrichum
近年的多重序列分析結果顯示引起葡萄晚 tropicale曾被報導可感染葡萄果實造成葡萄晚
腐病的病原菌，包括 Colletotrichum aenigma 腐病 (Duan et al. 2018; Lin et al. 2019; Duan &
(Yan et al. 2015)、Colletotrichum citri (Lei et Chen 2020)，其中 Duan & Chen (2020) 自台灣
al. 2016)、Colletotrichum fructicola (Peng et 中部主要葡萄產區之葡萄晚腐病果實上分離
al. 2013; Echeverrigaray et al. 2020; Lim et al. 24株炭疽病菌，透過分析internal transcribed
2020)、Colletotrichum godetiae (Zapparata et spacer (ITS)、glyceraldehyde-3-phosphatedehy-
al. 2017)、Colletotrichum hebeiense (Yan et al. drogenase (GAPDH)、beta-tubulin 2 (TUB2)、
2015)、Colletotrichum karstii、Colletotrichum actin (ACT) 與ApMat等5個基因的核酸序列，
kahawae、Colletotrichum limitticola、Colle- 並以C. viniferum菌株代號GZAAS5.08608為
totrichum nymphaeae (Echeverrigaray et al. 參考菌株的分析結果顯示其中 22 株與 C.
2020)，以及 Colletotrichum viniferum (Peng et viniferum 各基因序列的相同度最高 (98.2–
al. 2013; Lei et al. 2016; Oo & Oh 2017; Eche- 100%)，另 2 株與 C. tropicale 基因序列的相
verrigaray et al. 2020; Gao et al. 2020; Yokosa- 同度最高 (97.8–100%)。
wa et al. 2020) 等10個種，分屬於C. gloeospo- 為瞭解在台灣葡萄栽植區域引發葡萄晚腐
rioides 複合種、Colletotrichum acutatum複合 病之病原菌種類與特性，本研究自2012年起，
種以及Colletotrichum boninense複合種等。另 陸續前往苗栗、台中、彰化及南投等地區的重
外，intergenic sequence between Apn2 and 要葡萄產地及一處生鮮超市蒐集罹染晚腐病的
MAT1-2-1 (ApMat) 基因之序列被認為亦有助釐 葡萄果實、出現疑似病斑之枝條芽點、壞疽葉
清Colletotrichum spp.之分類 (Silva et al. 2012)。 片以及具壞疽斑的園區雜草 (牛筋草，Eleusine
根據ApMat基因序列所進行的分析發現，自日 indica)，分離得Colletotrichum spp.菌株後以
本重要葡萄產區之一的長野縣境內蒐集之葡萄 ITS、GAPDH、ACT及TUB2、chitin synthase
晚腐病菌為C. fructicola、Colletotrichum per- 1 (CHS-1) 等基因之核酸序列分析親緣關係，
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經由廣泛的調查，釐清引起台灣葡萄晚腐病 基因序列增幅與定序：將萃取自供試菌株
之主要炭疽病菌種類以及各菌種分布狀況， 之 gDNA 以特定引子對進行聚合酶鏈鎖反應
並透過人工接種試驗，確認主要病原菌C. vi- (polymerase chain reaction; PCR)，增幅的序列
niferum在葡萄幼果及葉片與其他組織之病原 包括 ITS (White et al. 1990)、GAPDH (Templeton
性及引起之病徵。 et al. 1992)、CHS-1 (Carbone & Kohn 1999)、
TUB2 (Glass & Donaldson 1995)、ACT (Car-
材料與方法 bone & Kohn 1999) 和ApMat (Silva et al. 2012)
等序列片段；所使用之引子對如各文獻所
葡萄晚腐病菌菌株分離與保存
列，惟一例外是用於增幅 TUB2 的前置引子
罹病植物組織採集地點包括苗栗縣卓蘭 (forward primer) T39 (5-ATCACAACAAC-
鎮、台中市霧峰區、后里區與新社區、彰化縣 GCTTGCGACG-3)，其為本研究自行設計。
大村鄉、南投縣埔里鎮、水里鄉與信義鄉等地 PCR 反應混合液 (20 μL) 包含 10 μL 耐熱聚
的葡萄栽培區，收集的樣本包括罹病果實、葉 合酶預混液 (Taq DNA polymerase 2× Master
片以及園區內出現褐色水浸狀病徵的雜草 (牛筋 Mix RED; Ampliqon, Odense, Denmark)，1 μL
草)。另外，也自大里區的生鮮超市收集罹病果 gDNA，10 μM引子對各1 μL以及7 μL ddH O。
2
實。分離菌株時，將待分離之組織用自來水清 PCR 反應流程為：95℃解旋反應 (denature)
洗過後，切取新鮮罹病部位約7 × 7 × 2 mm3， 5 min；95℃解旋反應30 s、56℃黏合反應 (an-
經0.5%次氯酸鈉 (NaClO) 表面消毒30 s，以擦 nealing) 30 s、72℃延長反應 (extension) 30 s，
手紙吸乾表面多餘水分後，放置於馬鈴薯葡萄糖 進行35次循環；最後以72℃ 7 min進行最終
瓊脂 (Potato dextrose agar, PDA; Difco, Lawrence, 延長反應。以瓊脂膠體電泳確認 PCR 增幅產
KS, USA) 平板培養基上，放置於室溫 (24– 物為單一明顯條帶後，送交源資國際生物股份
28℃) 1–2 d以純化分離菌株。收集葡萄葉片及 有限公司 (Tri-I Biotech Inc., New Taipei, Tai-
枝條的真菌分離株後，依下列公式計算各種菌 wan) 進行定序。
的組織分離率：分離出菌種的組織數量/該園 親緣關係樹分析：親緣演化分析共使用
區總分離之組織數量 × 100%。 126 株菌株的序列資料，包含本研究分離之
若有菌落疑似為Colletotrichum spp.時， 40 株供試菌株和 86 株參考菌株 (reference
選取單一分生孢子移植於新的PDA，並靜置 strain)，參考菌株的序列資料由美國國家生物
於室溫以 12 h 光週期培養 7 d，以觀察菌落 技術資訊中心 (National Center for Biotech-
與分生孢子形態，一旦確認為Colletotrichum nology Information; NCBI) 資料庫取得。將各
spp.，切取菌塊 (10 × 10 × 0.5 mm3)，移置於 基因之序列分別透過MEGA X軟體 (Kumar et
無菌礦物油 (100% mineral oil, Sigma, Burl- al. 2018) 以 Clustal W (Thompson et al. 1994)
ington, MA, USA) 中保存。 進行初步排列分析 (alignment)，再透過人工
方式進行序列的微調和確認，最終各基因片段
病原菌分子鑑定
用以構築單基因 (ApMat) 親緣關係樹或 3 基
真菌 genomic DNA (gDNA) 抽取：供試 因 (ITS + GAPDH + TUB2) 和 5 基因 (ITS +
菌株以PDA於25℃培養10 d後，刮取菌絲進 GAPDH + TUB2 + CHS-1 + ACT) 之多基因親
行研磨至呈粉末狀，其後添加500 μL CF buf- 緣關係樹。親緣關係樹利用最大似然法 (max-
fer (農業試驗所配方，未顯示資料) 混合均勻， imum likelihood; ML) 和貝葉斯法 (Bayesian
再用微量吸管將溶液吸取至1.5 mL 離心管， inference analysis; BI) 二種演算方法進行構
以 11,269× g 離心 10 min。吸取 200 μL 上清 築，最適取代模型透過線上分析軟體 Smart
液移至新的1.5 mL 離心管，並於 100℃乾浴加 Model Selection (Lefort et al. 2017) 和MEGA
熱10 min後，將核酸以ddH O稀釋10×後放 X軟體進行預測，其中最大似然法不分基因區
2
置於-20℃保存備用。 段預測，貝葉斯法則依各基因區段單獨預測，
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結果如表1。最大似然法親緣關係樹之構築透 台中后里區1處果園，挑選初結果1 mo內之
過MEGA X軟體執行，並以啟發式 (heuristic 果串，將在樹上持續發育的供試果串全部浸泡
method) 方法中nearest neighbour interchange 入置備好的分生孢子懸浮液中10 s，再以白色
(NNI) 之方式搜索樹型，最終演化樹分支的支 紙袋將果串封緊避免與外界直接接觸並避免雨
持度以拔靴法 (bootstrap) 進行 1,000次取樣來 水流入，持續觀察供試果串生長過程及病徵表
檢驗。貝葉斯法之親緣關係樹利用MrBayers 現，直至結果 1.5 mo 後果實轉色成熟。每菌
v. 3.2.7 (Ronquist et al. 2012) 構築，建構過程 株接種7串以上。
採用馬可夫鏈蒙地卡羅 (Markov chain monte 植株接種：於溫室內，取種植於盆栽中高
carlo; MCMC) 演算法，運行 1,000,000 代， 約110–150 cm並經催芽2 mo後之植株 (具葉
每 1,000 棵樹取樣一次，前 25% 之樹屏除， 片與嫩梢)，以上述置備好的分生孢子懸浮液
剩餘之樹用以取得共同樹 (或稱一致樹；con- 噴霧全部植株，包括葉片正面、背面以及嫩梢
sensus tree)，並顯示後驗機率 (posterior prob- 等，直至水滴滑落，每處理共5盆。以透明塑
abilities; PP)，表示對此親緣樹分支的支持度， 膠袋開口朝下，由上往下將植株套起，套入前
最終親緣關係樹以FigTree v. 1.4.4 (Molecular 以噴霧器噴水使塑膠袋內部表面維持有水珠狀
evolution, phylogenetics and epidemiology 態。靠近植株頂端的塑膠袋角落以剪刀剪出長
2018) 進行繪製。 約5–7 cm的開口，每個角落各 2刀，以使植
株能透氣。接種植株置入28℃、12 h光週期的
病原性測試
走入式生長箱，持續觀察。
菌株以 PDA 培養並以 12 h 光週期培養
菌株型態與生長觀察
10–14 d，以無菌水搜集分生孢子，並將濃度
調成 1 × 106孢子 mL-1之懸浮液，添加稀釋 為觀察C. viniferum次支序群T菌株型態，
10,000× 展著劑 (加收活展；興農股份有限公 以 F217069、F217131、F217133 與 F217141
司，台灣台中市)，製成接種源。以「巨峰」葡 作為供試菌株，培養在PDA 平板培養基，以
萄 (‘Kyoho’) 為供試植物，並以無菌水取代分 22–24℃、12 h光週期方式培養7–10 d後觀察
生孢子懸浮液作為對照組，以下列方法進行接 菌落型態，並挑取培養基表面的分生孢子記
種。罹病組織隨後再進行組織分離，確認分得 錄。刺激壓器生成方式為將分生孢子以 0.5%
相同病原菌以完成柯霍氏法則。 V8 做成懸浮液，滴在載玻片上並保濕，以
果實接種：2017–2018年夏季與秋季時於 22–24℃無光照的方式培養 2 d 後觀察。使用
表1.　本研究各親緣關係分析所使用的核甘酸替換模型。
Table 1.　Nucleotide substitution models used in phylogenetic analyses in this study.
1 gene phylogenetic tree 3 genes phylogenetic tree 5 genes phylogenetic tree
Maximum Bayesian inference Maximum Bayesian inference Maximum Bayesian inference
Gene/locusz likelihood analysis likelihood analysis likelihood analysis
ApMat K80y HKY + G - - - -
ITS -x - T92 + G GTR + G GTR + G GTR + G
GAPDH - - T92 + G HKY + G GTR + G GTR + G
TUB2 - - T92 + G GTR + G GTR + G GTR + G
CHS-1 - - - - GTR + G K80 + G
ACT - - - - GTR + G GTR + G
z ApMat: intergenic sequence between Apn2 and MAT1-2-1; ITS: internal transcribed spacer; GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase; TUB2: beta-tubulin 2; CHS-1: chitin synthase; ACT: actin.
y K80: Kimura 2-parameter; T92: Tamura 3-parameter; GTR: general time reversible; HKY: Hasegawa-Kishino-Yano; G: gamma
distribution.
x Not used in analysis.
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的顯微鏡為Olympus BX40 (Olympus, Tokyo, 另一方面，也到曾發生晚腐病之葡萄果
Japan)，拍照設備為Canon 50 D (Canon, Tokyo, 園，於葡萄果實發育過程及採收後，分別採
Japan)。為觀察菌絲生長狀況，菌株在 PDA 集出現褐化病徵之葡萄葉片 (以下分別稱為
上黑暗培養3–5 d後，切下菌落邊緣之新鮮菌 『產季罹病葉片』及『採收後罹病葉片』)；並
塊，移植於PDA培養基的邊緣，放置於4–40℃ 於果實採收後，採集外觀出現疑似壞疽、褐斑
(以4℃為間距，共10個溫度)，每個溫度下每 之枝條及芽點 (以下稱為『具褐斑的枝條或芽
菌株每次測試 3 皿，即 3 重複，測試不同溫 點』)。自這些病組織分離真菌菌株的結果顯
度下菌絲生長速率。每日記錄菌絲直線生長 示Colletotrichum spp.之分離率相當高，其他
距離，部分溫度下於 10 d即長滿培養基，故 Pestalotiopsis sp.、Botryosphaeriaceae、Al-
測量1–9 d的生長數據，每皿每日生長速率計 ternaria sp.、Diaporthe sp.以及Fusaruim sp.
算方法為 (生長滿9 d距離 − 生長滿1 d距離) 等真菌亦有一定比例 (表2)。『產季罹病葉片』、
cm/8 d (單位：cm d-1)，取3重複數之平均值 『採收後罹病葉片』及『具褐斑的枝條或芽點』
代表該菌株。試驗重複3次。 的 Colletotrichum屬菌株分離率分別為35.9、
92.3 及 41.7%，後續各自其中挑選 6、4 及 1
結果 株代表性分離株進行後續分析 (表2)。
此外，在一個曾發生葡萄晚腐病之果園採
葡萄晚腐病菌株分離
集到呈現褐色水浸狀病徵之雜草，組織分離及
自2012–2020年間，陸續自台灣各地葡萄 鏡檢後發現所獲菌株是C. gloeosporioides s.l.，
產區，包括苗栗縣 (卓蘭鎮)、台中市 (新社區、 挑選其中1株分離株和前述Colletotrichum屬
霧峰區及后里區)、彰化縣 (大村鄉)、南投縣 菌株一併進行親緣關係分析。以上共計40株
(信義鄉、水里鄉、國姓鄉及埔里鎮) 等地，以 Colletotrichum菌株，詳細分離來源請見表3。
及台中市大里區的生鮮超市蒐集出現晚腐病徵
多重序列親緣關係分析
之葡萄果實；目標病徵包括果實表面出現針點
狀黑色凸起物或橘色孢子堆，以及果肉軟腐。 為鑑定前述 40 個分離株的種類，由已知
鏡檢發現所獲得的菌株之分生孢子皆為透明、 研究挑選51株隸屬於Colletotrichum屬菌株做
中央具明顯油滴、兩端圓鈍之長桿狀孢子，初 為參考菌株 (Weir et al. 2012; Peng et al. 2013;
步鑑定為 C. gloeosporioides s.l. (Sutton 1992; Yan et al. 2015; de Silva et al. 2019)， 其 中
Weir et al. 2012)。從中挑選 28株進一步進行 包含 31 種模式菌株 (type strain)；為在已知
核酸序列分析。 資料庫中尋得更相近於本研究之已知菌種，
表2.　台灣2015–2019年間，各真菌於葡萄不同生長階段或組織之分離比例。
Table 2.　Isolation percentages of fungi isolated in different stages or diseased tissues of grape during 2015–2019 in
Taiwan.
Diseased leaves
Isolation percentages (%) Before fruits were harvested After fruits were harvested Shoot or budz
Colletotrichum sp. 35.9 92.3 41.7
Pestalotiopsis sp. 23.4 76.9 75.0
Botryosphaeriaceae 15.6 15.4 63.2
Alternaria sp. 32.8 19.2 11.8
Phomopsis sp. 12.5 25.0 36.8
Fusarium sp. 15.6 50.0 33.3
Others 70.3 15.4 29.9
z Brown spots or lesions on the shoots or buds before sprouting.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 113399 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::4466140 台灣農業研究　第71卷　第2期
3 7 0 4 2 9 1 5 6 7 8 9
4 4 4 4 4 3 4 4 4 3 3 4
ApMat - W8352 W8352 - - - - W8352 W8352 - - - W8352 W8352 - W8352 - W8352 W8352 - - - W8352 W8352 W8352
M M M M M M M M M M M M
9 0 5 2 8 8 2 7 2 7 1 5 8 5 6 8 1 3 4 8 9 0 3 4 5
6 7 7 8 8 9 0 6 7 7 8 9 6 6 6 0 7 7 7 7 7 8 8 8 8
1 6 6 6 6 6 6 7 6 6 6 6 6 6 6 6 7 6 6 6 6 6 6 6 6 6
S- 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 27 80 80 80 80 80 80 80 80 80
H 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 9 4 4 4 4 4 4 4 4 4
C W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W
M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M
6 7 2 9 5 5 9 4 9 4 8 2 5 2 3 7 8 0 1 5 6 7 0 1 2
5 5 6 6 7 8 8 5 5 6 6 8 5 5 5 0 5 6 6 6 6 6 7 7 7
UB2 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 9277 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892 4892
T W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W
M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M
k.
Ban 587 588 593 600 606 616 620 585 590 595 599 613 586 583 584 706 589 591 592 596 597 598 601 602 603
n T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0
e C 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 2 8 8 8 8 8 8 8 8 8
s in G A MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW9 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4 MW4
er
sion numb GAPDH MW480628 MW480629 MW480634 MW480641 MW480647 MW480657 MW480661 MZ128124 MW480631 MW480636 MW480640 MW480654 MW480627 MW480624 MW480625 MW927709 MW480630 MW480632 MW480633 MW480637 MW480638 MW480639 MW480642 MW480643 MW480644
s
e
c
c
a 6 7 2 9 5 5 9 4 9 4 8 2 5 2 3 7 8 0 1 5 6 7 0 1 2
nd y 259 259 260 260 261 262 262 259 259 260 260 262 259 259 259 085 259 260 260 260 260 260 261 261 261
a S 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 9 9 9 9 9 9 9 9 9
on IT W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W9 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4 W4
。 ati M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M
m
在的序列號碼GenBank s study and related infor YearLocation 2015Xinshe 2015Xinshe 2016Xinshe 2017Puli 2017Xinyi 2018Xinshe 2020Xinyi 2012Dacun 2016Dacun 2016Dacun 2017Dacun 2018Xinshe 2015Supermarket at Taichung 2012Zhuolan 2012Guoxing 2015Xinshe 2015Xinshe 2016Xinshe 2016Xinshe 2016Shuili 2017Wufeng 2017Dacun 2017Puli 2017Puli 2017Dacun
錄 hi e
與其登 ated in t Source leaf fruit weed Eleusin)ndica leaf leaf leaf fruit fruit twig leaf leaf leaf fruit fruit fruit fruit fruit fruit leaf fruit fruit fruit leaf fruit leaf
訊 ol (i
s
菌株相關資 which were i zIsolate F215089 F215147 F216037 F217125 F217155 F218126 t220155 F212108 F216025 F216082 F217120 F218113 F215071 F212083 F212087 F215090 F215149 F216035 F216036 F216184 F217069 F217115 F217131 F217133 F217141
之 s
集 ate
蒐 ol
本研究分離與表　3.　List of the isTable 3. Species Colletotrichum fructicola Colletotrichum tropicale Colletotrichum viniferum subclade TC. viniferum
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114400 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::4466葡萄晚腐病的發生調查 141
n
e
e
w
ApMat - - - - - - - - - - - - - - - ce bet
n
e
u
q
e
87 89 90 91 92 93 94 96 97 99 00 01 03 04 05 c s
CHS-1 MW4806 MW4806 MW4806 MW4806 MW4806 MW4806 MW4806 MW4806 MW4806 MW4806 MW4807 MW4807 MW4807 MW4807 MW4807 : intergeniat
continued) TUB2 MW489274 MW489276 MW489277 MW489278 MW489279 MW489280 MW489281 MW489283 MW489284 MW489286 MW489287 MW489288 MW489290 MW489291 MW489292 nthase; ApM
k. ( n sy
Ban 605 607 608 609 610 611 612 614 615 617 618 619 621 622 623 chiti
en CT 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 : 1
菌株相關資訊與其登錄在的序列號碼。續GenBank() which were isolated in this study and related information and accession numbers in G zyIsolateSourceYearLocationGAPDHAITS F217153fruit2017XinyiMW492614MW480646MW4 F217177fruit2017DacunMW492616MW480648MW4 F217179fruit2017WufengMW492617MW480649MW4 F217209fruit2017DacunMW492618MW480650MW4 F217211fruit2017DacunMW492619MW480651MW4 F218102fruit2018XinsheMW492620MW480652MW4 F218110fruit2018XinsheMW492621MW480653MW4 F218118fruit2018XinsheMW492623MW480655MW4 F218123fruit2018XinsheMW492624MW480656MW4 F218130fruit2018XinsheMW492626MW480658MW4 t220153fruit2020XinyiMW492627MW480659MW4 t220154fruit2020XinyiMW492628MW480660MW4 t220156fruit2020XinyiMW492630MW480662MW4 t220157fruit2020XinyiMW492631MW480663MW4 t220158fruit2020XinyiMW492632MW480664MW4 seased mature fruits which showed typical ripe rot of grape or lesions on leaves or twigs.: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; : actin; : beta-tubulin 2; GAPDHACTTUB2CHS-
本研究分離與蒐集之表　3.　List of the isolates Table 3. Species z All isolates were isolated from diy : internal transcribed spacer;ITS Apn2 and MAT1-2-1.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114411 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::4466142 台灣農業研究　第71卷　第2期
加以用 F215069 之 GADPH 和 TUB2 基因為
為參代相為近表考CJ1.的進 1菌v與i已行n株i知fBJe 2r(L菌-u表1Am；株S)4T C各)一。分G併2R利析株S納1搜用共入與尋I4分T，C株S析G、挑 R；(A選菌QC以1序株T。上、列代已共T與號U知5B之分52皆別株、最 Reference et alWeir . (2012) et alYan . (2015) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alde Silva . (2019) et alWeir . (2012)
GAPDH、及 CHS-1 等 5 個基因的聯合序列
針對前述總共95株菌建構最大概率親緣關係 at
M
樹的分析結果顯示 (圖 1)，本研究的 40 株菌 p - - - - - - - - - - -
A
可鑑定為 3 種 Colletotrichum sp.，其中 28 株
與&vin ZCifi.e rYvui.n mYif參ienrgu考m模菌 L式株. 菌J親. 株P緣e及n關g其, 係L他. 較分Ca相離i, 自近K中.， D國構. H的成y一dCe. TUB2 JX010389 KF288964 JX010406 JX010384 JX010392 JX010383 JX010411 JX010386 JX010420 KX094285 JX010438
個穩定的C. viniferum支序群，拔靴法支撐數
值斯tie 事s()b 後為oo概t0s.率t9r9a數，p 值可su p鑑(pB定oaryt為 evsaiCalu.n e vpsino) is為fteerr9uio6mr%； p，7ro株而ba與貝bi葉lCi-. ers. CHS JX009774 KF289005 JX009867 JX009753 JX009799 JX009837 JX009882 JX009755 JX009853 KX094083 JX009877
b
m
f數定ru為值ct為iCco. 7lfa6ru%的c，t菌ic而o株l貝a形；葉成5斯株一事與支後C序概. 群t率ro，數pi拔c值a靴l為e法的1支，菌撐株鑑 ession nu ACT JX009443 KF377529 JX009584 JX009576 JX009483 JX009471 JX009572 JX009552 JX009564 KX093982 JX009537
c
形成一支序群，拔靴法支撐數值為91%，而貝 ac
葉(圖斯1事)。後概率數值為1，可鑑定為C. tropicale 碼。 ation and GAPDH JX010044 KF377492 JX010053 JX009915 JX009930 JX009990 JX010028 JX009959 JX010005 KX094183 JX009989
親緣關係分析也顯示C. viniferum支序群明 號 m
次撐顯數包支值含序小群2於個C。次50但支%須序而注群貝意，葉次分斯支別事序稱後群為概次率T支的值序拔為群靴0.法7T4，與支 的序列nk elated infor ITS JX010244 KF156860 FJ972612 JX010192 JX010176 JX010190 JX010251 JX010246 JX010205 KX094252 JX010265
而低，次說支明序這群樣C的則分分群別方為式6可7%能與還0不.9是9，很數穩值定皆。較 GenBa y and r 5.4
株次n3為i個f菌支eCr分.中自序u mt離r，台群o參2株p灣4Ti考c株，，田al菌2 1e間(占 株株株(或3全為. 同6生(體3%C屬.鮮6)8.； %於5超fr.)自7u次 市%c與「t支葡i)產源c 屬o萄序季l自a於果群 罹中(C7實C病.國.1 分，v%葉的in離)而片，iCf之e」其.1r uv2所他株mi8- 株相關資訊與其登錄在 e isolates used in this stud Isolates ICMP18608, C1253.4 JZB330025, B1 ICMP18580, BPDI4, C131 ICMP18696, C1187 ICMP17673, 3-1-3 ICMP17919, C1275.5 ICMP12071, C824 ICMP18621, C1194.22 ICMP18537, C1282.4 CMM4268 ICMP18658, C1317.1
獲得的 6 個分離株中，1 株為 C. viniferum 次 菌 c
n
支t中C褐t(rr圖.oo ，斑序ppf1rii2的ccu)群。aac株枝llteeiTc；；為條、ol『自a或3C，採株.雜芽 v收及為i草點n後i』1分fCe株罹.分r離 uf病r為m離的uc次到葉Ct菌i.c的片支 株otr』l代o序a為p，的表i群cC另性a4.lT e個菌f2、r；u株株分1c自t為為i株離c『o株為具CCla.. 本研究使用之參考表　4.　List of the refereTable 4. Species Colletotrichum aenigma Colletotrichum asianum Colletotrichum aeschynomenes Colletotrichum alatae Colletotrichum alienum Colletotrichum aotearoa Colletotrichum chrysophilum Colletotrichum clidemiae
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114422 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::4477葡萄晚腐病的發生調查 143
Reference et alWeir . (2012) et alDiao . (2017) et alde Silva . (2019) et alDiao . (2017) et alWeir . (2012) et alYokosawa . (2020) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alYan . (2015) et alWeir . (2012) et alDiao . (2017) et alYan . (2015) et alde Silva . (2019) et alYan . (2015) et alWeir . (2012) et alde Silva . (2019) et alde Silva . (2019) et alWeir . (2012) et alDiao . (2017) et alWeir . (2012) et alDiao . (2017) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012)
8
at 83
ApM - - - - Q807 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
J
TUB2 X010440 P890174 H846566 P145469 X010405 X010409 X010388 C297102 Q005587 M034811 F288975 Y856532 X010450 X010444 H846563 H846561 Q596280 X010395 X010398 X010399 X010443 X010414 X010412 X010403 X010404
d) J K M K J J J K J H K K J J M M H J J J J J J J J
e
u
ers. (contin CHS JX009864 KP890156 MH805853 KP145385 JX009866 JX009874 JX009772 KC296987 JQ005326 HM034805 KF289008 KY856190 JX009752 JX009813 MH805850 MH805848 JX009896 JX009815 JX009835 JX009836 JX009901 JX009899 JX009890 JX009863 JX009865
b
ession num ACT HM470235 KP890144 MH781483 KP145329 JX009501 JX009581 JX009491 KC296941 JQ005500 HM034801 KF377532 KY856023 JX009438 JX009452 MH781480 MH781478 JX009433 JX009432 JX009437 JX009582 JX009515 JX009447 JX009490 JX009562 JX009518
c
c
碼。續() ation and a GAPDH JX009975 KP890162 MH707467 KP145413 JX010033 JX010032 JX009998 KC297010 JQ005239 HM034807 KF377495 KY856274 GQ329681 JX010012 MH728820 MH728821 JX010050 JX010015 JX009972 JX010031 JX009967 JX009934 JX010036 JX009916 JX009924
號 m
的序列nk elated infor ITS JX010226 KP890168 MH728809 KP145441 JX010165 JX010173 JX010167 KC297078 JQ005152 HM034809 KF156863 KY856450 GQ329690 JX010231 MH728812 MH728815 JX010146 JX010142 JX010187 JX010188 JX010219 JX010276 JX010185 JX010242 JX010171
Ba d r
相關資訊與其登錄在Gen solates used in this study an Isolates CMP18579, LC0955, C1315.1 CAUG17 UOM1137, F5-2D CAUG28 CBS130416, ICMP18581, C1315.3, LC0033 CBS125397, C1316.21 ICMP18613, C1253.2 CBS132879 CBS112999, ICMP17821 CORCG5 JZB330028, K3 CBS142411, CPC 28153 ICMP10492, C1180.1 ICMP17816, C1266.1 CBS143664, CPC28612 CPC28556 CBS116870, ICMP19119 ICMP17817, C1266.11, IMI52264 CBS470.96, ICMP18187, C1275.25 CBS472.96, C1275.26, ICMP17940 CBS145.29 ICMP1778 ICMP18705, C956.1 ICMP19051, C1314 ICMP18578, C1315.2
株 e i I
究使用之參考菌 st of the referenc m cordylinicola m conoides m endophyticum m fructicola m grevilleae m gloeosporioides m hebeiense m hystricis m horri m kahawae m makassarense m musae m nupharicola m psidii m queenslandicum m salsolae m siamense
本研表　4.　LiTable 4. Species Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu Colletotrichu
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114433 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::4477144 台灣農業研究　第71卷　第2期
0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0)
Reference et alde Silva . (2019) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alWeir . (2012) et alde Silva . (2019) et alde Silva . (2019) et alde Silva . (2019) et alheverrigaray . (202 et alheverrigaray . (202 et alheverrigaray . (202 et alheverrigaray . (202 et alheverrigaray . (202 et alheverrigaray . (202 et alheverrigaray . (202 et alheverrigaray . (202 Oo & Oh (2017) et alYan . (2015) et alYan . (2015) et alYan . (2015) et alde Silva . (2019) et alPeng . (2013); et alYokosawa . (2020)
c c c c c c c c
E E E E E E E E
2
at 24
M 3
Ap - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - J62 - - - -
K
d) TUB2 KM404170 JX010415 JX010447 JX010442 JX010407 MH846562 MH846558 MH846570 MN785082 MN785091 MN785095 MN785097 MN785098 MN785099 MN785100 MN785103 MG182342 JN412813 KF288962 KF288963 KP145468 JN412811 KF288979 KF288978 KJ534675 KJ534676
e
u
ers. (contin CHS KC598113 JX009895 JX009869 JX009898 JX009870 MH805849 MH805845 MH805857 - - - - - - - - - - KF288989 KF288998 KP145384 - KF289012 KF289011 KJ534709 KJ534708
b
ession num ACT KC702922 HM131507 JX009444 JX009520 JX009489 MH781479 MH781475 MH781487 - - - - - - - - - JN412795 KF377513 KF377522 KP145328 JN412793 KF377537 KF377536 KJ534740 KJ534739
c
c
碼。續() ation and a GAPDH KC702955 HM131497 JX010006 JX009952 JX010007 MH707464 MH728823 MH728819 MN785021 MN785030 MN785034 MN785036 MN785037 MN785038 MN785039 MN785042 MG182341 JN412798 KF377476 KF377485 KP145412 JN412800 KF377500 KF377498 KJ534750 KJ534749
號 m
的序列nk elated infor ITS KC702994 HM131511 JX010294 JX010269 JX010264 MH728814 MH728818 MH728805 MN758919 MN758928 MN758932 MN758934 MN758935 MN758936 MN758937 MN758940 MG182340 JN412804 KF156846 KF156854 KP145440 JN412802 KF156868 KF156867 KJ534683 KJ534682
Ba d r
相關資訊與其登錄在Gen olates used in this study an Isolates CMM3814 BS130420, LC921, LLTA01 ICMP18649, CBS124945, C1316.13 ICMP4832 MP18653, CBS124949, 5101 CPC28607 CBS143666, UOM1298T, CPC30245 UOM1290 CI026 CI036 CA041 CA043 CA044 LMF18-1 LMF18-2 LMF18-6 CNU171001 GZAAS5.08601, yg1 JZB330008, G12-1 JZB330017, PTT3-1 CAUG27 GZAAS5.08608, gg4 J11 J2-1 CGRS1 CGRQ1
s C C
株 e i I
菌 c
考 en a
本研究使用之參表　4.　List of the referTable 4. Species Colletotrichum theobromicol Colletotrichum ti Colletotrichum tropicale Colletotrichum tainanense Colletotrichum viniferum subclade CC. viniferum
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114444 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::4477葡萄晚腐病的發生調查 145
0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0)
2) 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 2)
1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1
eference et al. (20 et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et alwa . ( et al. (20
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碼。續() ation and GAPDH JX009927 - - - - - - - - - - - - - - - JQ005240
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的序列nk elated infor ITS JX010261 - - - - - - - - - - - - - - - JQ005153
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錄在 s stu 094, 5
關資訊與其登 ates used in thi Isolates P17903, BRIP45 16-15 16-16 17-18-3 17-25-1 17-25-2 16-13 16-37 16-103 16-106 16-107 16-108 17-17-1 17-17-2 17-33-2 17-47-2 CBS12375
相 ol M
株 e is IC
究使用之參考菌 st of the referenc m xanthorrhoeae etotrichum bonin-
本研表　4.　LiTable 4. Species Colletotrichu Clade V outgroup Coll ense
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114455 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::4477146 台灣農業研究　第71卷　第2期
圖1.　以Colletotrichum gloeosporioides複合種共95個菌株建構之最大概率親緣關係樹，以ITS、GAPDH、
TUB2、ACT及CHS-1 genes等5基因建構之。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114466 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::5500葡萄晚腐病的發生調查 147
Fig. 1.　A maximum likelihood phylogenetic tree based on 95 isolates of Colletotrichum gloeosporioides species
complex. The tree was generated using concatenated sequences of genes encoding the ribosomal internal transcribed
spacer (ITS), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), beta-tubulin 2 (TUB2), actin (ACT) and chitin
synthase 1 (CHS-1). The bootstrap support values (≥ 50%) and Bayesian posterior probabilities (PP ≥ 0.5) are dis-
played at the nodes. The tree was rooted to Colletotrichum boninense (CBS 123755). The bar indicates 0.02 expected
changes per site. Type strains are displayed in bold. Isolates of this study which isolated from different tissues are
indicated by colors: leaves in green, fruits in blue, twigs in purple, and weeds in red.
C. viniferum次支序群T與其他C. viniferum 斯事後概率數值為0.97，與台灣的次支序群 T
菌株的親緣關係 及中國的次支序群C可明顯區別。分離自生鮮
超市果實的 F215071 菌株與次支序群 C 之 C.
為瞭解C. viniferum次支序群T與其他地
viniferum 模式菌株 (GZAAS5.08601) 分屬於
域C. viniferum菌株的親緣關係，本研究收集
同一支序群。ApMat序列構築的親緣關係結果
目前已發表之C. viniferum核酸序列資料進行
與前述分析5個基因之序列所獲結論一致。
分析，但由於各研究團隊用以分析的核酸序列
種類未必相同，以下親緣分析分為二個部分進 C. viniferum次支序群 T 的菌株特性描
行。Echeverrigaray et al. (2020) 與 Oo & Oh 述及在葡萄造成之病徵
(2017) 個別發表自巴西 (8 株) 與韓國 (1 株) 本研究自罹病葡萄葉片與果實分離的菌株
收集的C. viniferum菌株，因Oo & Oh (2017) 主要屬於C. viniferum次支序群T，以F217069
僅公布並分析 ITS、GAPDH 與 TUB2 等基因 為代表性菌株，描述其特徵如下：菌落為灰色
的核酸序列 (表4)，因此第一部分分析也採取 到灰綠色，氣生菌絲生長平鋪至微蓬鬆；分生
相同策略，納入分析的菌株包括本研究所分離
孢子透明，長橢圓形 (cylindrical)，兩端圓鈍
的C. viniferum次支序群T菌株8株與次支序 或偶有一端稍微尖起，具明顯液胞；長度為
群C菌株1株、源自中國的次支序群C菌株9 12.4-14.0-16.0 μm (min.-avg.-max.)，寬度為
株，以及外群菌株 1 株，共 28 株菌，根據上 4.8-5.3-6.0 μm，長寬比為 2.2-2.6-3.3 (表 5、
述3基因的序列作親緣關係分析 (圖2)，結果 圖4)。壓器 (appressorium) 為灰綠色到褐棕色
顯示所有C. viniferum分離株初步細分成3個 之間，多數為不規則的卵狀 (irregular ovoid)
分群，並與分離地區具相關性，其中巴西分群 或棍棒狀 (clavate)，邊緣為圓鋸齒狀 (cren-
的8菌株可再分成關係相近的2小群。原屬於 ate)，偶而出現不規則裂瓣 (lobed)；長度為
C. viniferum次支序群T之台灣菌株與巴西菌 8.0-10.9-15.6 μm，寬度為 4.4-6.8-10.0 μm (表
群的親緣關係較近，原屬於C. viniferum次支 5、圖4)。菌絲最適生長溫度為 28℃，4℃以下
序群 C 的台灣菌株 F215071 與韓國 1 菌株則 以及40℃以上無法生長。另針對菌株F217131、
與中國菌群較接近。 F217133與F217141所進行的分析顯示，其壓
第二部分分析聚焦於探討台灣 C. vi- 器與分生孢子之形態均與F217069相似，最適
niferum 次支序群 T 與跟 C. viniferum 具高度 生長溫度也是 28℃，但菌株生長速度與菌落
親緣關係之日本支序群 V 菌株 (Yokosawa et 特徵呈現些微差異：F217131 的菌落型態與
al. 2020) 的親緣關係；Yokosawa et al. (2020) F217069 相似，F217133 與 F2171413 的菌落
以 ApMat 基因序列建構親緣關係樹，因此本 為深墨綠色至灰白色，帶淡黃色。
研究也採取相同策略，納入分析的菌株包括本 C. viniferum次支序群 T菌株在田間栽植
研究分離之C. viniferum次支序群T菌株8株、 葡萄所引起的病徵主要包括：罹病葡萄葉片出
C. viniferum次支序群C菌株1株，以及參考 現葉緣局部或大面積壞疽，並且伴隨明顯大範
菌株 17 株 (表 4)，共 26 株菌 (圖 3)。分析結 圍的黃暈 (圖5A–C)；若果實罹病，成熟葡萄
果顯示，台灣的次支序群 T 及中國的次支序 果粒腐爛、皺縮，表面出現黑色、顆粒、輪紋
群 C 較相近，日本分群 V 之菌株自成一支序 排列的分生孢子盤，濕度高時出現橘色菌泥 (圖
群，支序群的拔靴法支撐數值為 86% 而貝葉 5D、E)。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114477 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::5500148 台灣農業研究　第71卷　第2期
圖2.　以Colletotrichum gloeosporioides複合種共28菌株以ITS、GAPDH及TUB2等3基因建構之最大概率
親緣關係樹。
Fig. 2.　A maximum likelihood phylogenetic tree of 28 isolates of Colletotrichum gloeosporioides species complex.
The tree was generated using concatenated sequences of internal transcribed spacer (ITS), glyceraldehyde-3-phos-
phate dehydrogenase (GAPDH) and beta-tubulin 2 (TUB2) genes. The tree was rooted to Colletotrichum tropicale
(CBS 124949). The bar indicates 0.002 expected changes per site. Type strains are displayed in bold. Colletotrichum
viniferum isolates from different countries are indicated by colors: China in red, Taiwan in purple, South Korea in
blue, and Brazil in green.
C. viniferum次支序群 T 菌株之病原性 群T菌株進行病原性測試，供試菌株包括分離
測試 自罹病果實的菌株F217069與F217133，及分
離自罹病葉片的菌株 F217141 與 F217131，
為瞭解 C. viniferum 次支序群 T 的病原 以葡萄園植株幼果或生長箱盆栽植株所進行的
性，選擇不同組織來源的C. viniferum次支序 接種試驗顯示：(1) 果實接種：以 F217069、
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114488 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::5522葡萄晚腐病的發生調查 149
圖3.　以Colletotrichum gloeosporioides複合種共26菌株之ApMat基因建構之最大概率親緣關係樹。
Fig. 3.　A maximum likelihood phylogenetic tree of 26 isolates of Colletotrichum gloeosporioides species complex.
The tree was generated using intergenic sequence between Apn2 and MAT1-2-1 (ApMat) partial sequence. The boot-
strap support values (≥ 50%) and Bayesian posterior probabilities (≥ 0.5) are displayed at the nodes. The tree was
rooted to Colletotrichum fructicola (CBS 130416). The bar indicates 0.005 expected changes per site. Type strains
are displayed in bold. Colletotrichum viniferum isolates from different countries or Japanese clade V are indicated by
colors: China in red, Taiwan in purple, and Japanese clade V in orange.
F217133、F217141 及 F217131 等菌株之孢子 可分離得相同病原菌，故依柯霍氏法則確認其
懸浮液個別接種於葡萄幼果 5 wk後，接種果 病原性。(2) 盆栽植株接種：於生長箱內，以
實皆出現點狀、塊狀或網狀紫褐色病斑；果實 孢子懸浮液噴布葡萄盆栽植株，感染3–5 d後，
開始轉色前，病斑逐漸擴大並出現紫紅色暈 上述4個供試菌株皆可造成葉片壞疽腐爛 (圖
圈；果實轉色後至成熟期間，病斑褐化，果實 7A、B)；感染 10–14 d 後，接種葉片皆出現
凹陷、果肉軟爛，果粒逐漸皺縮，表面出現黑 壞疽、黃化、落葉，但個別菌株造成的病徵稍
色點狀同心圓排列的病兆，環境適合下產生橘 有不同：F217069與F217133引發葉脈褐化 (圖
色菌泥；接種無菌水的對照組則無病徵出現 (圖 7C)，F217133 與 F217131 造成葉片斑點病徵
6)。以上 4個菌株分別接種葡萄幼果所造成的 (圖7D)。此外，4個菌株皆可造成卷鬚與花穗
病徵與在田間觀察到的葡萄晚腐病徵相同，且 褐化壞疽 (圖7E、F)。相對的，處理無菌水的
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 114499 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::5544150 台灣農業研究　第71卷　第2期
表5.　Colletotrichum viniferum 次支序群T型態與生理特徵。
Table 5.　Synopsis of morphological and physical data of the Colletotrichum viniferum subclade T isolates in Tai-
wan.
Conidia length × Appressorium length Mycelium growth
width min.-avg.-max × width min.-avg.- Optimum temp. for rate at optimum temp.
Isolate no. (μm) max (μm) Length width ratio mycelium growth (mm d-1)
F217069 12.4-14.0-16.0 × 8.0-10.9-15.6 × 2.2-2.6-3.3 28℃ 5.4
4.8-5.3-6.0 4.4-6.8-10.0
F217131 12.0-13.6-15.6 × 9.0-12.6-17.0 × 2.0-2.5-3.1 28℃ 5.0
4.8-5.4-6 6.0-6.7-9.0
F217133 12.8-14.9-16.4 × 7.6-8.7-10.4 × 2.46-3.1-3.7 28℃ 4.6
4.4-4.8-5.6 3.6-4.4-6.0
F217141 11.6-13.1-14.8 × 8.0-10.7-20.0 × 2.4-2.8-3.3 28℃ 3.9
4.4-4.7-5.2 4.8-5.8-8.8
圖4.　Colletotrichum viniferum 次支序群T菌株型態特徵。由左至右，正面菌落、背面菌落、分生孢子、壓器。
Fig. 4.　Morphological features of isolates of Colletotrichum viniferum subclade T. The top and reverse views of a
colony, conidia, and appressoria of each isolate were illustrated in one row from left to right. Cultures were grown on
PDA at 22–24℃ under 12 h light period for 7 to 9 d. Conidia were from 7-day PDA cultures. Appressoria formed on
glass slides and developed from conidia suspended in 0.25–0.5% V8 juice for 24 h. Bar = 10 μm.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 115500 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::5566葡萄晚腐病的發生調查 151
圖5.　Colletotrichum viniferum 次支序群T在田間引起之 (A–C) 葡萄葉片與 (D、E) 果實病徵。
Fig. 5.　The typical fi eld symptoms caused by Colletotrichum viniferum subclade T, including (A–C) diseased leaves
and (D, E) fruits.
圖6.　田間幼果人工接種Colletotrichum viniferum 次支序群T菌株F217069在果實成熟後形成之病徵。
Fig. 6.　Symptoms of grape fruits (cultivar: ‘Kyoho’) inoculated by the isolate F217069 of Colletotrichum viniferum
subclade T. These 1-month-old fruits in the orchard were inoculated in planta with the conidia spore suspension (1 ×
106 conidia mL-1) of the isolate. The typical symptoms of grape ripe rot appeared after veraison.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 115511 22002222//66//2244 下下午午 0022::4488::5599152 台灣農業研究　第71卷　第2期
圖7.　溫室植株人工接種Colletotrichum viniferum 次支序群T菌株 (A–C, E, F) F217069或 (D) F217133後在
葉片、卷鬚或花上形成之病徵。
Fig. 7.　Symptoms of grape leaves (cultivar: ‘Kyoho’), young shoots and blossom inoculated by the isolate (A–C,
E, F) F217069 or (D) F217133 of Colletotrichum viniferum subclade T in greenhouse assays. The potted plants were
inoculated with the conidia spore suspension (1 × 106 conidia mL-1) and then were kept in 28℃ and high humidity
condition (relative humidity; RH > 85%).
對照組完全無病徵。自上述呈現病徵的部位均 la (7.1%)，1株為C. tropicale (3.6%)。鑑定為
可再分離得相同病原菌，完成柯霍氏法則。 C. viniferum的菌株中，計有24株屬於C. vi-
niferum次支分群T，分離比例高達85.7%，另
討論 1株(3.6%) 與C. viniferum GZAAS5.08601 (模
式菌株) 和 GZAAS5.08608 等菌株同屬於 C.
C. viniferum次支序群 T 為台灣主要葡
viniferum次支序群C。
萄晚腐病菌
這些結果顯示C. viniferum次支分群T為
為釐清台灣葡萄晚腐病菌種類與病原田間 台灣葡萄果實晚腐病菌的主要病原族群，先前
分布狀況，本研究於2012–2020年自苗栗、台 的研究也支持C. viniferum為台灣葡萄果實晚
中市、彰化，以及南投等地的葡萄產區，共逾 腐病菌的結論 (Duan & Chen 2020)，但這些
35場次之葡萄園蒐集可疑病害組織。從分生孢 分離株究竟屬於C. viniferum次支序群T或次
子形態初判，自葡萄果實分離的Colletotrichum 支序群C仍待進一步分析。
分離株皆為C. gloeosporioides s. l.，隨機挑選 特別一提的是，本研究之次支序群T的菌
其中28株進行多重序列親緣關係分析，發現25 株型態與屬於次支序群C的C. viniferum標準
株為C. viniferum (89.4%)，2株為C. fructico- 株 (Peng et al. 2013) 相似，但本研究之次支
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 115522 22002222//66//2244 下下午午 0022::4499::0011葡萄晚腐病的發生調查 153
序群T菌株菌絲最適生長溫度為28℃，較標準 C. viniferum次支序群 T 亦可感染田間
株的25℃稍高。 葡萄葉片
C. viniferum次支序群具地域相關性 除了葡萄果實，本研究也在其他組織發現
藉由建構 ACT、CHS-1、GAPDH、TUB2 Colletotrichum spp.具高分離比例。尤其『產季
以及ITS的多序列親緣關係樹，C. viniferum在 罹病葉片』到『採收後乾枯葉片』，Colletotrichum
中國大陸首次被記錄 (Peng et al. 2013)。特別 屬菌株的分離率由35.9%提高到92.3%。分別
的是，再經Yan et al. (2015) 的研究發現即便 自『產季罹病葉片』菌株隨機取樣6株、『採收
都是分 離自中國的 C. viniferum 菌株仍顯現 後乾枯葉片』菌株隨機取樣4株，親緣分析結
遺傳歧異度，似可再區分為不同支序群或甚 果顯示其分別有1 與 2 株菌株屬C. viniferum
至分種。本研究參考 Yan et al. (2015) 自 C. 次支序群T (表2、圖1)。
viniferum 各支序群選擇代表菌株做為「C. vi- 自C. viniferum次支序群T菌株中選取4株
niferum參考菌株」，這些菌株與C. viniferum 代表菌株進行接種試驗，自罹病葉片分離得的
次支序群 T 明顯區隔，和 F215071 同被歸納 C. viniferum次支序群T菌株 (F217133與F217147)
於 C. viniferum 次支序群 C (圖 1)；不過，次 可感染果實引起典型晚腐病徵；反之由罹病果
支序群 T 與次支序群 C 的拔靴法支撐數值及 實分離得的菌株 (F217069與F217131) 亦可感染
貝葉斯事後概率數值皆不高，其分群穩定度仍 葉片引起葉片壞疽。各菌株在果實或植株造成
待進一步驗證。另透過ITS、GAPDH與TUB2 之病徵雖有些微差異但大致相似：接種 1 mo
等基因的親緣關係分析，C. viniferum次支序 後直至果實轉色前才出現病徵，顯示潛伏感染
群 T、次支序群 C 及巴西菌株明顯依來源區 的可能性 (圖6)。盆栽植株接種試驗中，除可
域分屬於不同的支序群，而韓國菌株與C. vi- 感染葉片外，亦可感染嫩梢與花穗 (圖7E、F)。
niferum 次支序群 C 屬於相同分群 (圖 2)，顯 本研究的調查與試驗說明C. viniferum次支序
示地理區隔在菌群分化的重要角色。 群 T 的菌株在田間可交互感染葉片與果實，
Yokosawa et al. (2020) 利用 ApMat 基因 且試驗結果顯示菌株對嫩梢與花穗等具高病原
分析日本長野縣葡萄晚腐病菌，親緣關係分析 性。在相同接種條件下，部分菌株出現葉片病
結果顯示，該地區葡萄晚腐病主要病原為「分 徵不盡相同的狀況，推測可能是因為菌株病原
群 V」菌株群，其與 C. viniferum 模式菌株親 性之差異或葉片生理狀態不同所造成，Yan et
緣關係相近，雖有差異，但未達另立新種的程 al. (2015) 的研究也顯示 C. viniferum 不同分
度。本研究參考 Yokosawa et al. (2020) 的分 離株對葡萄的致病力的確存在由低到高的廣泛
析方法，同樣利用 ApMat 基因進行分析的結 變異，確切決定因素仍需要未來驗證。
果發現日本的分群V的菌株可與C. viniferum
其他Colletotrichum菌種分離狀況與病
次支序群T及次支序群C的菌株有明顯區隔，
原性
顯示 ApMat 基因可以明顯區分不同地域來源
的菌株 (圖 3)。事實上，以 ApMat 基因序列 部分Colletotrichum屬親緣種如Colletotrichum
進行分析時，F215071菌株與源自中國的次支 capsici (Sawant et al. 2012; Pan et al. 2016)、C. go-
序群 C 菌株 GZAAS5.08601 (C. viniferum 模 detiae (Baroncelli et al. 2014) 以及C. nymphaeae
式菌株) 分屬於同一支序群，與前述分析5個 (Liu et al. 2016) 等可感染葡萄枝條引起葡萄
基因之序列所獲結論一致。F215071菌株係分 植株炭疽病 (grapevine anthracnose)。此外，C.
離自台中生鮮超市葡萄果實，雖然欠缺果實種 capsici雖可在田間感染葡萄葉片，但未有感染
植來源記錄，根據序列資料，很難排除其自國 葡萄果實的紀錄；不過，溫室試驗證實其可感
外移入的可能性，未來仍需更多的證據才能確 染葡萄果實，因此也可能具備在田間引發晚腐
認。 病的潛力 (Pan et al. 2016)；然而，並非所有
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 115533 22002222//66//2244 下下午午 0022::4499::0022154 台灣農業研究　第71卷　第2期
存在於葡萄枝條的Colletotrichum spp.皆會感 誌謝
染葡萄造成損失，例如分離自葡萄枝條上的C.
本文承蒙行政院農業委員會農業試驗所
dematium 與C. siamense，係以腐生方式存在
104 農科-10.6.3-農-C1(8)、105 農科-10.5.3-
於枝條表面 (Jayawardena et al. 2018)。本研
農-C1(7)、106農科-9.5.2-農-C1(2)，以及107
究在『葡萄果實晚腐病』、『採收後焦枯之葡
農科-8.4.2-農-C1(8) 計畫經費支持，農業試驗
萄葉』和『產季間果園內雜草』等組織分離得C.
所陸明德助理研究員提供植株供試，陳品儒、
viniferum、C. fructicola，以及C. tropicale等，
黃麟婷與林建毅等助理協助調查與進行試驗。
另在葡萄園罹病雜草也分離得C. fructicola，
這些菌株對葡萄果實的病原性與致病力仍有待
引用文獻
未來釐清。除了Colletotrichum屬之外，自『產
季罹病葉片』、『採收後乾枯葉片』以及『枝條 Baroncelli, R., S. Sreenivasaprasad, C. R. Lane, M. R.
Thon, and S. A. Sukno. 2014. First report of Col-
或芽點壞疽斑』還可分離Pestalotiopsis、Bo-
letotrichum acutatum sensu lato (Colletotrichum
tryosphaeriaceae、Alternaria sp.、Phomopsis godetiae) causing anthracnose on grapevine (Vitis
sp.和Fusaruim sp.等多種真菌，其病原性也有 vinifera) in the United Kingdom. New Dis. Rep.
29:26. doi:10.5197/j.2044-0588.2014.029.026
待確認。
Cai, L., K. D. Hyde, P. W. J. Taylor, B. S. Weir, J. M.
台灣晚腐病調查結論 Waller, M. M. Abang, J. Z. Zhang, Y. L. Yang, S.
Phoulivong, Z. Y. Liu, H. Prihastuti, R. G. Shivas,
總結以上，本研究發現在台灣引發葡萄晚 E. H. C. McKenzie, and P. R. Johnston. 2009. A
腐病菌主要的菌群為C. viniferum次支序群T， polyphasic approach for studying Colletotrichum.
Fungal Divers. 39:183–204.
且根據菌株分離結果最早於2012年即記錄得
Carbone, I. and L. M. Kohn, 1999. A method for de-
其存在，可知次支序群T至少從2012年開始
signing primer sets for speciation studies in fil-
即存在於田區，分布範圍包括台灣主要及次要 amentous ascomycetes. Mycologia 91:553–556.
葡萄產地。次支序群 T 可感染葡萄果實、葉 doi:10.2307/3761358
片、嫩梢、花穗，並於葉片上造成壞疽、黃化、 de Silva, D. D., J. Z. Groenewald, P. W. Crous, P. K.
Ades, A. Nasruddin, O. Mongkolporn, and P. W. J.
斑點及葉脈褐化等病徵。田間生態方面，在葡
Taylor. 2019. Identification, prevalence and patho-
萄果實採收後，C. viniferum次支序群T仍持 genicity of Colletotrichum species causing anthrac-
續殘存在葉片上，可成為下季感染來源；在葡 nose of Capsicum annuum in Asia. IMA fungus
10:8. doi:10.1186/s43008-019-0001-y
萄萌芽期，若遇環境條件適合，藏匿於枝條病
Diao, Y. Z., C. Zhang, F. Liu, W. Z. Wang, L. Liu, L. Cai,
斑、殘存之罹病葉片或落葉的病原菌可在短時
and X. L. Liu. 2017. Colletotrichum species causing
間內產生大量分生孢子，藉由雨水噴濺到新生 anthracnose disease of chili in China. Persoonia
38:20–37. doi:10.3767/003158517X692788
葉片上 (圖 5A–C；圖 7A–D)，也可能藉由噴
Duan, C. H., H. R. Pan, and C. C. Wang. 2018. Identifi-
濺感染田間嫩梢或花穗 (圖7E、F)。至結果期，
cation, pathogenicity and fungicide sensitivity of
C. viniferum再從葉片伺機感染幼果，並以『潛 Colletotrichum isolates from five fruit crops in Tai-
伏感染』的方式蟄伏至果實轉色後才顯現病徵 wan. Taiwan Pestic. Sci. 5:91–111. (in Chinese with
English abstract) doi:10.6671/TPS.201812_(5).06
(圖5D、E、圖6)。因此，葉片甚至花穗與嫩
Duan, C. H. and G. Y. Chen. 2020. Molecular identifica-
梢皆可能成為果實晚腐病的重要感染源，要做
tion and fungicide sensitivity of Colletotrichum iso-
好葡萄晚腐病防治，得在萌芽期起即密切注意 lates from grape in Taiwan. J. Plant Med. 62(4):23–
葉片與花穗等是否出現疑似病徵；此外，由於 32. (in Chinese with English abstract) doi:10.6716/
JPM.202012_62(4).0003
花穗病徵與露菌病造成的徵狀相近，必須小心
Echeverrigaray, S., F. J. Scariot, G. Fontanella, F. Fa-
區分，以避免因誤診導致誤用，錯失關鍵防治
varon, L. Sella, M. C. Santos, J. Schwambach,
時機。 C. Pedrotti, and A. P. L. Delamare. 2020. Colle-
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0044 林林筑筑蘋蘋((清清))..iinndddd 115544 22002222//66//2244 下下午午 0022::4499::0022葡萄晚腐病的發生調查 155
totrichum species causing grape ripe rot disease Lin, C. P., J. N. Tsai, and P. J. Ann. 2019. Preliminary
in Vitis labrusca and V. vinifera varieties in the report of Colletotrichum viniferum and oth-
highlands of southern Brazil. Plant Pathol. 69:1504– er new species of Colletotrichum sp. As Grape
1512. doi:10.1111/ppa.13240 Ripe Rot Causing Pathogens in Taiwan. J. Plant
Gao, H., X. Yin, X. Jiang, H. Shi, Y. Yang, C. Wang, X. Med. 61(2–3):74. (in Chinese) doi:10.6716/
Dai, Y. Chen, and X. Wu. 2020. Diversity and spoil- JPM.201909_61(2_3).0006
age potential of microbial communities associated Liu, M., W. Zhang, Y. Zhou, Y. Liu, J. Y. Yan, X. H. Li, R.
with grape sour rot in eastern coastal areas of China. S. Jayawardena, and K. D. Hyde. 2016. First report
PeerJ 8:e9376. doi:10.7717/peerj.9376 of twig anthracnose on grapevine caused by Colle-
Glass, N. L. and G. C. Donaldson. 1995. Development totrichum nymphaeae in China. Plan Dis. 100:2530.
of primer sets designed for use with the PCR to doi:10.1094/PDIS-05-16-0632-PDN
amplify conserved genes from filamentous asco- Molecular evolution, phylogenetics and epidemiology.
mycetes. Appl. Environ. Microbiol. 61:1323–1330. 2018. Figtree v1.4.4. Molecular evolution, phylo-
doi:10.1128/aem.61.4.1323-1330.1995 genetics and epidemiology, Edinburgh, Scotland.
Jayawardena, R. S., K. D. Hyde, K. W. T. Chethana, D. A. http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ (visit on
Daranagama, A. J. Dissanayake,