CRISPR-Cas9 脫靶效應：挑戰和解決方案
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文章來源 : 農業科技決策資訊平台 2025-08-15
CRISPR-Cas9源自於細菌和古細菌的免疫系統中，當受到病毒感染時，細菌會轉錄出特定短重複序列的RNA以辨識具互補序列的病毒DNA，再引導酵素破壞病毒DNA，成功抵禦病毒入侵。科學家利用這套系統設計基因編輯技術，首先設計一段嚮導RNA(gRNA)以辨識目標序列，再結合DNA裂解酶-Cas9將DNA斷開，插入或刪除序列使基因改變，簡而言之，CRISPR-Cas9是由RNA及酵素製成的分子剪刀。儘管這項技術在醫學及農業上皆極具潛力，仍存在脫靶編輯(off-target editing)的風險，意指分子剪刀錯誤辨認序列導致非目標基因修飾，造成非預期的基因啟動或去活化如啟動癌症相關基因、細胞毒性、免疫反應、降低治療的潛力等疑慮。
為減少基因編輯的脫靶效應，科學家開發了多種策略包含脫靶檢測、sgRNA優化、Cas9核酸酶修飾等方法
以下簡介4種方法：
1.脫靶檢測：
基於演算法開發的電腦工具如CasOT、Cas-OFFinder等能夠預測由sgRNA導致的脫靶效應風險，同時開發多種定序方式如Digenome-seq、CIRCLE-seq、SITE-seq能夠辨認基因體中裂解的位點，Discover–seq甚至能 在活體組織中偵測脫靶效應。
2.sgRNA優化：
針對嚮導RNA進行修飾，如設計短序列的gRNA、提升GC含量至40%-60%、添加2'-氧-甲基-3'-膦醯乙酸酯(2′-O-methyl-3′-phosphonoacetate)進行化學修飾等方式降低脫靶效應。
3.Cas9核酸酶異構體：
例如Cas9切口酶(Cas9 nickase)與一般的Cas9不同，僅會切除單股DNA，或者修飾Cas9中序列鄰近構形(protospacer adjacent motif, PAM)，降低非標的位點辨認及結合，以降低脫靶風險。
4.改善遞送方式：
基因編輯的活性取決於編輯系統在細胞內的時間及表達程度，因此將CRISPR-Cas9送入細胞中的方式同樣影響脫靶效應，常見的方法如病毒傳導、核醣核蛋白電穿孔(ribonucleoprotein electroporation)、植體轉染等，其中以核醣核蛋白電穿孔脫靶效應機率最低。
隨著這些新興技術的開發與優化，CRISPR-Cas9 正朝向更安全與精準的方向發展，未來有望在治療疾病及改良作物等方面發揮更大的作用。
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