豆科根瘤菌及其應用(上) - 農業知識入口網

豆科與根瘤菌的重要性
豆科（Leguminosae）為被子植物第三大科（family），約有751個屬（genus）和19,500個種（species），豆科分3個亞科，即雲實亞科（Caesalpinioideae）、含羞草亞科（Mimosoideae）及蝶形花亞科（Papilionoideae），在全球分佈甚廣，具有重要的生態和經濟價值。豆科植物與固氮根瘤菌之間的共生關係已經發展出現在過去的6,500萬年前，豆科與根瘤菌共生的重大生態意義占全球氮循環的25%左右。至今豆科是人類糧食、飼料、油類及綠肥來源，是主要的高蛋白質及油類種子作物，根瘤菌的貢獻及重要性因此受世人之矚目。至今在應用推廣固氮菌上，則以豆科根瘤菌的應用為多，並已有相當正面的應用成效。
在農業生產中豆科根瘤菌共生固氮有極重要的作用，但目前在全球共生固氮由豆科植物占耕地上施肥總量的13%，共生固氮之潛力有待開發。全球根據估計由特定作物的固氮中，收穫的氮有70%載於豆科植物，其中90%是在苜蓿植物。每年全球的生物固氮量約為175x106公噸，是工業固氮的3倍。其中農田固定的氮素約90x106公噸，而根瘤菌與豆科植物的共生固氮能力居各類固氮體系之首，約37x106公噸，這是約為生物固定為氮肥總氮的40%。

植物生長發育需要三要素氮、磷、鉀，即是作物需求量最大的肥料，唯一能來自大氣中的就是氮（N），雖然大氣存有80%的大量氮氣（N2），但此種氮氣不能直接被高等植物利用，需要將氮氣轉化成氨之後，才能被高等植物利用，此種將氮氣還原轉化為氨的過程謂之「固氮作用」。地球上的固氮作用主要包括「生物固氮」及「工業固氮」。「生物固氮」是自然界的固氮微生物的作用，氮氣經由固氮細菌、放線菌或藍綠藻菌等原核微生物之固氮酵素（nitrogenase）轉化成為氨態氮，進而再合成有機的氮化合物（如胺基酸），農業上應用此類最多的微生物是屬於豆科之根瘤菌，根瘤菌進入豆科的根部形成根瘤，固定氮素供應高等植物所需之氮源。豆科與根瘤菌共生，可以固定氮素，獲得大量氮素營養，因此，根瘤菌被認為是微生物肥料，並在農業上應用根瘤菌接種劑已超過120年。豆科的施氮肥量只要禾本科的1/4∼1/2，一般施用化肥愈多，土壤酸化越嚴重，對環境污染亦越嚴重。

根瘤菌在水稻及其他非豆科作物中也普遍存在，並對植物有促進生長之作用，根瘤菌與非豆科植物並不能形成根瘤，而促進植物生長之作用可能不是生物固氮，而是產生植物激素、影響根的發育或促進土壤中營養元素的吸收等功能。在研究根瘤菌的應用上，也發現在土壤及根圈環境中的非共生根瘤菌具有修復重金屬、降解污染物及纖維素、生物防治、促進植物生長作用等功能。現代農業栽培管理上，影響土壤微生物相平衡或有益微生物生長的因子不可忽視。尤其是以過度使用農用化學物（農藥及化肥），加上土壤環境的污染，對原本天生天長的土壤微生物影響甚鉅，必須加以重視豆科輪作系統及保育土壤微生物，才會有健康的土壤及安全的食物。

固氮菌的種類－根瘤菌是固氮微生物之一種
土壤中固氮菌的種類甚多，但都是屬於無細胞核的原核生物（prokaryotes），包括有細菌（如根瘤菌、化學營細菌、光合硫化細菌等）、放線菌（如木麻黃、赤楊、楊梅等之共生根瘤菌）、藍綠藻（如念珠藻屬、魚腥藻屬）等，其中在生態的系統上又可區分為游離性（free-living）、協生性（associative）及共生依性（symbiotic）的固氮作用。根瘤菌是固氮的微生物之一的共生性固氮菌。共生性固氮菌與高等或低等植物共生的菌種，有特殊構造（如瘤狀體或囊狀體）。例如細菌的根瘤菌及放線菌，分別與豆科及非豆科高等植物共生形成能固定空氣中氮氣的根瘤，另有藍綠藻與低等植物共生的現象（如滿江紅）等。除了植物根部的共生固氮菌外，莖葉上也有共生固氮的微生物，但應用上則甚少。

協同性固氮菌則分布在根圈及葉圈上，無明顯共生構造的關係，其中在禾本科根部協生的固氮螺旋菌（Azospirillum）為最著名，至今固氮螺旋菌有15種，其中本研究室即發表命名4個新種Azospirillum fermentarium、Azospirillum formosense、Azospirillum picis、Azospirillum rugosum。非共生固氮菌即為游離性之固氮菌是分布在陸地及水體中，在土壤中的種類甚多，從藍綠藻至細菌都有其例，如水田中固氮藍綠藻及光合細菌都有非共生固氮作用者。其中光合細菌能利用光能及CO2，在表土及水田中增加土壤有機碳素。固氮的微生物均含有固氮酵素（nitrogenase），其作用除固氮外，另具有還原乙炔、氰化物、丙二烯、疊氮化物、氧化亞氮及氫離子之功能（表1）。

根瘤菌的分類
根瘤菌（rhizobia）最早自1889年分離出來，至今已有100多年。最早的根瘤菌分類系統是在1932年由Fred提出，此系統以相互接種族為依據，各族根瘤菌分別以其優勢宿主植物命名。因為發現同一宿主植物之菌種有快生及慢生型的世代時間不同（圖1），開始發現同一宿主植物之菌種間也有不同。近年來分子生物學分析的進步，在微生物的分類上有了新的發展，主要是利用16S rDNA及DNA-DNA雜合的差異為重點，及配合其他生化分析的分類法，於是新種之分類一一出現。根瘤菌的分類正在蓬勃發展中，不斷發掘新的根瘤菌資源，根瘤菌的分類體系也逐漸完善。根瘤菌科（Rhizobiaceae）的下屬包括：根瘤菌屬（Rhizobium）、劍菌屬（Ensifer，前稱中華根瘤菌屬Sinorhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）及Shinella，依據最新基因體系統分類學分析顯示根瘤菌科中之根瘤菌屬／土壤桿菌屬組和Shinella／劍菌屬組為兩個主要超級分化支。至今根瘤菌分布在α型及β型變形菌門（Proteobacteria），發現至少共15屬，其中α型至少13屬，包括Bosea（3種）、Bradyrhizobium（16種）、Ochrobactrum（2種）、Devosia（1種）、Methylobacterium（1種）、Microvirga（3種）、Aminobacter（2種）、Mesorhizobium（28種）、Phyllobacterium （4種）、Rhizobium（93種）、Shinella（1種）、Sinorhizobium／Ensifer（12種／7種）、Azorhizobium（2種）、及β型至少有兩屬包括Burkholderia（7種）及Cupriavidus （1種）。

其中以根瘤菌屬（Rhizobium）之菌種數為最多，本研究室也在臺灣發現三株新種（於IJSEM期刊命名為Rhizobium alvei、Rhizobium capsici、及Rhizobium straminoryzae）。也從Mesorhizobium loti及Phyllobacterium myrsinacearum 中命名一個新屬新種Oricola cellulosilytica。根瘤菌分類學之新描述的物種是由國際農桿菌和根瘤菌分類小組委員會（the International Taxonomy Subcommittee on Agrobacterium and Rhizobium）定期修改。
根瘤菌科（Rhizobiaceae）中有一農桿菌屬（Agrobacterium），會導致植物產生腫瘤，但不能固氮作用，是農作物的病菌。因農桿菌帶一個Ti質體，在農桿菌感染植物時，其中有一段DNA會插入植物的基因體，於是農桿菌被大量應用在植物基因轉的工具上，甚至優於基因槍之技術，也算是根瘤菌科的一個奇兵，但農桿菌的載體序列也會出現在基改植物中是被質疑的問題。

根瘤菌的特性
根瘤菌是革蘭氏陰性、游動性、非孢子桿菌。根瘤菌與豆料植物之共生固氮體系中具有根瘤菌結瘤基因組（nod和hsn基因）、固氮基因組（nif和fix基因）等基因，經豆料植物之分泌物之誘導作用，使根瘤菌能順利進入根毛到植體根部內皮層中，經根瘤菌與植物間之互動形成根瘤及表現固氮作用。期間根瘤菌獲得植物的能源、碳源及養分轉變成類菌體，在豆血紅蛋白保護下固氮酵素（nitrogenase）將氮轉化為氨，之後將氨轉化為胺基類（如穀氨醯胺、尿囊素等）的氮化合物提供植物利用，形成互利的共生體系。

在根瘤菌與豆料植物之共生固氮體系上，豆料植物可減少作物施用氮肥，減少環境中氮的污染與土壤酸化，提高豆科的產量與品質，並增進土壤肥力與健康，減少化學氮肥施用，有助節約消耗不可再生性能源的目標。Schubert and Wolk（1982）指出豆科固氮作用所消耗植物本身的能量，約等於植物吸收及利用硝態氮（NO3-）的能量，解開以往只對豆科固氮耗能的誤解。生物接種劑生產成本低及應用簡便，而在工業生產化學氮肥（如尿素）則消耗大量能源及運輸施用經費等，每生產1公噸之化肥氮需要約1.3公噸之石油。

自然界的任何「同種」的微生物均有功能性優劣之別，因此，根瘤菌的應用上，以篩選優良菌種為首要工作，需從分離及純化後，進行初步溫室與最後的田間篩選工作，篩出適應性與共生性最優的菌系，以優勢菌株的接種劑做為應用的接種劑（圖2）。根瘤菌的接種劑在應用上甚為簡便，只要與種子混合後即可播種，使用菌液量每公頃約為2∼4公升，而在一般常見毛豆每公頃使用尿素約在200∼400公斤，相比之下，即見使用根瘤菌可省時、省錢及省力之特性。

根瘤菌一般有豆科宿主的專一性或偏好性，意即大豆根瘤菌，只能用在大豆作物，不能用在落花生之接種應用。因此，大部份的根瘤菌只限在特定豆科上應用為主，最近本研究室才針對非豆科及禾本科作物採用篩選之固氮溶磷根瘤菌之多功能根瘤菌，因此，固氮溶磷根瘤菌不僅可應用在豆科作物上，亦可應用於非豆科及禾本科作物，擴大根瘤菌應用，用於非豆科之根圈溶磷功能為目標。

文圖/楊秋忠 教育部終生榮譽國家講座教授、國立中興大學土壤環境科學系教授