菇類菌種保存方法 - 農業知識入口網

人們會使用溫度為攝氏-196 度的液態氮來保存卵子、幹細胞、植物的種子及孢子等，甚至是菇類的菌種。而菇類的菌種保存方法不僅此一種，我們將在本文討論菇類菌種的更多保存方法。

菇類菌種和人類的卵子一樣，都會有「適齡」與否的嚴重問題，老化的菌種會產生基因變異，良好的產能或香氣等特性將受到影響，不良的菌種將影響整個菇類產業，筆者認為優良的菌種、穩定的生產與順暢的行銷是3 大成功要素，而菌種則是一切的根基。

保存菇類菌種之重要性
菇類菌種如同植物的種子一般，是菇類栽培的源頭，菌種活力如同種子活力，對於菇類栽培的產量和品質是非常重要的。有了好的菌種，接下來就是生產流程，管控菇體的品質與產量，最後當然是要賣得出去，而且賣個好價格，因此行銷是最後一個重要因子。

臺灣有句俗話：「歹竹出好筍。」這句話用在菇類是行不通的，如果一開始沒有好的菌種，結果就只會每況愈下、越來越糟而已。

菇類隸屬於真菌界，菇類的菌種會產生變異的原因是由於過度擴大繁殖，菇類營養生殖的構造稱為菌絲，繁殖時菌絲細胞進行有絲分裂而形成新的菌絲，有絲分裂過程偶爾會發生基因重組或突變，故有絲分裂的次數越多，造成基因變異的機率也越大。

日本學者Fukui 等人（2012）研究發現，利用攝氏4 度保存140 天的香菇菌種，所接種之太空包，平均每包產量為200 克（太空包重1.2 公斤），而如果菌種連續移植10 次後所製成的菌種接種太空包，產量則嚴重退化至每包80 克，只剩原本的4 成產量，顯示良好的菌種保存才能確保菇類產量的穩定。

為避免優良菌種產生變異，有好的菌種時建議要凍齡，馬上保存起來，而平時使用中之菌種，則建議減低菌種移植次數，藉以減少有絲分裂的次數，降低變異的風險。不過要以液態氮來保存菇類菌種，成本上較高昂，如果不是大型企業或專業菌種中心，要定時維持液態氮是件麻煩的事，因為液態氮會揮發，至少1 個月得補充1次，所以光是工錢就比液態氮還貴了。

菌種製作是整個菇類生產過程中，非常專業且關鍵的領域，必須透過一定的訓練，經由良好的無菌操作技術，方能確保菌種的生產過程不受任何雜菌汙染。此外，一個良好的菌株，如何永久保存其生理及遺傳特性，則是許多菌種商所面臨的挑戰，筆者走訪菇農時，常發現他們會向不同的菌種商購買菌種，雖然這是一種避險的做法，但這種菌種來源與品質不一的狀況，會連帶造成菇農生產時非常大的困擾。

部分的菌種商並沒有保存菌種的習慣，一直沿用從菇體分離的方式製作菌種，然筆者發現從菇體分離並無法保證菌種的活力，如果菇體本身的狀況不是最好的，所分離的菌種活力也會很差。因此，在菇類長遠的生產體系下，仍建議建立適當的菌種保存流程。

菌種保存的原則，是讓菇類菌絲保有活性卻減緩其代謝活性，進而暫時停滯或延緩生長，自然情況下，通常是在低溫或低氧氣濃度的環境下，可以達到這樣的效果，因此許多保存方法均是根據這樣的原則開發，包括繼代培養法、礦物油覆蓋法、無菌水懸浮保存法、低溫冷凍保存法及超低溫冷凍法，其中超低溫冷凍法對於菇類菌種活性及各種遺傳性狀維持之效果最好，但保存成本也最昂貴。

菇類菌種保存方法
本文介紹幾種簡單的菇類菌種保存方法，希望能提供菌種生產業者，或是有意自行生產菌種之菇農作為參考：

1. 繼代培養法：
是一般菇農最常使用的方法，即在菌種製作時，將菌絲塊移植至數根裝有馬鈴薯葡萄糖洋菜（Potato dextrose agar,PDA）培養基的試管內，待菌絲長滿後放置於攝氏4 度冰箱，每半年更新1 次，中間需要重新製作菌種時，每次只取出1 管擴大培養，其他仍繼續保存在攝氏4 度，如此可以減少移植次數，進而降低菌種產生變異的機率。這種方法雖然費時，但操作簡便，且所需費用相當低。

另外，在菌種保存過程中，為避免產生脫水現象，製作菌種保存用的試管斜面培養基時，可以增加培養基的量，由原本的10 ml 增加至12 ml，滅菌完後排成斜面時，讓底部多留2 ～ 3 公分的高度，雖然會縮小斜面的長度，但可避免菌種在保存的過程中，培養基因水分蒸發過快而乾掉，導致菌絲死亡的現象。

需要製作菌種時，只要取出其中1 根菌種移植即可，這樣的保存方法建議為6 個月至1 年，屬於短期保存方法。部分菇種放攝氏4 度會直接出菇，例如金針菇、秀珍菇等菇種，建議改用其他的保存方式較適宜。

2. 礦物油覆蓋法：
礦物油覆蓋法是藉由防止脫水及降低氧氣消耗，而達到延緩菌絲生長與代謝活性的原理，以保存菌種。做法是將滅過菌的礦物油直接倒在長滿PDA 試管斜面菇類菌絲上，礦物油下方1 公分以下的真菌菌絲，在覆蓋後數小時之內，因為氧氣降至正常值的1 ／ 10，代謝作用也會隨之降低，此法適用於不產生孢子的真菌菌絲保存。

但礦物油覆蓋的厚度如果超過1公分，會影響氧氣穿透，反而不利於菌種保存，同時，如果在無氧狀態下，礦物油對真菌的菌絲具有毒害性。最好使用醫藥級的礦物油，放入玻璃瓶或血清瓶中以高溫高壓滅菌1 小時，然後在烘箱中乾燥至表面水氣完全蒸散，待冷卻後，於試管中加入適當的量至完全覆蓋斜面培養基為止。此法可將菌種保存於室溫，一般菇農使用較便宜的棉花塞封住試管瓶口，久而久之容易吸引紅蜘蛛，建議可以在表面加上一層玻璃紙，一方面減少礦物油蒸發，同時也可避免紅蜘蛛感染。

3. 無菌水懸浮保存法：
利用無菌水保存菌種的原理，也是透過減少氧氣以降低菌絲代謝生長活性，有效減低移植次數，操作簡單，菌種亦可保存長達數月之久。

首先將菌種培養於裝有PDA 之試管或培養皿中，待菌絲長滿，以移植針切取生長於菌落邊緣之菌絲塊（直徑0.3 ～0.5 公分），移植於消毒過的蒸餾水中，封好瓶口，放入攝氏4 度冰箱中保存或置於室溫下即可。移植時直接以移植針取出菌絲塊，放置於新的培養基讓其生長。有些菇類不適合於攝氏4 度保存，例如靈芝、木耳、巴西蘑菇等菇種，可放置室溫或是攝氏16 度下。

4. 小米低溫冷凍保存法：
在低溫冷凍時，細胞內的水會結成冰晶，解凍的過程中，冰晶會刺傷細胞膜，導致細胞破裂而死，因此為提高保存菌絲細胞的存活率，除了控制降溫的速度之外，同時得加入適當的抗凍劑保護細胞，減少冰晶形成。

一般常使用的抗凍劑分成兩型，一種具穿透性，可以穿透細胞膜，在細胞內和細胞外都有良好的保護效果，例如二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和甘油，二甲基亞碸對人體皮膚有刺激性及滲透性，雖然毒性低，但因其本身容易溶解其他毒性物質，並攜帶滲入人體，而有使用疑慮，一般較常使用甘油。另一種則為非穿透性，較少使用，如不同種類的醣類，蔗糖、糖醇及糊精等，藉由改變細胞內溶質的濃度，以減少細胞脫水程度。

2001 年日本Hirasawa 等學者利用海藻醣處理酵母菌的細胞，發現可提高細胞內的海藻糖濃度，有助於增加酵母菌保存於攝氏-20 度下的存活能力。2008年陳勁初博士也發表利用海藻醣保存樟芝菌種，發現1 年之後，菌絲的存活率依然良好。

為了讓菌種在冷凍情況下仍保有活力，利用小米保存比用菌絲塊更能延長菌種保存時間。此一方法是將菇類菌種培養於PDA 培養皿中，然後置於攝氏24 度之定溫箱培養7 ～ 10 天，將小米先稍微泡水後，將水瀝乾，消毒後將小米倒入長有菌絲的試管中，待菌絲長滿小米表面，將小米移至保存管中，再加入消毒過的10％甘油或1M 海藻糖溶液，封好瓶口，經室溫靜置過夜，讓甘油或海藻醣可滲入細胞內，然後置於攝氏-80 度下保存。

一般菇農不大可能購買攝氏-80 度的冰櫃，建議可購買小型攝氏-20 度的冷凍櫃（不會自動除霜，溫度才會穩定。不像家裡冰箱的冷凍櫃，重複除霜及解凍的過程，造成溫度變化大，影響菌種保存活性）。另外，在放置於攝氏-20度之前，可以先於攝氏4 度冰箱中放置半天至1 天的時間，以減少溫度驟降、對於菌種之負面影響。

需要製作菌種時，將保存管取出，先置於攝氏37 度的溫水中快速解凍，之後再去除抗凍劑，將小米放置於培養基中，待菌絲長出即可移植或製作菌種。

5. 木屑保存法：
日本學者Kitamoto 等人（2002）發現利用木屑可以保存金針菇菌種超過10年，因此也非常適合做為其他菇類菌種保存。做法是1.5 克木屑+0.45 克米糠，然後將含水量調整為64％左右，分裝至保存管中，經過消毒後，放入菇類菌絲塊，待菌絲長滿木屑，即可放入攝氏-20或-80 度的冰箱，如果要重複解凍使用，建議在木屑中加入10％甘油。取用時只要直接解凍，然後取出一小部分木屑菌種放在培養基平板上生長即可，非常方便。不過為了菌種保存的最佳活性，建議不要重複解凍，以1 次使用為宜。

有句諺語說：「不要把所有的雞蛋放在同一個籃子裡。」由於沒有一種方式能夠百分之百保證菇類菌種的活力不會退化，而不同的菇種或菌株對於不同的保存方法也有其不同的適應性，因此為了避險，建議同一個菌種至少使用兩種以上的保存方式，以防因跳電或其他不明原因，造成無法取得活力較佳之菌種作為接種源；此外，在擴大繁殖前，最好先進行少量的出菇試種，確定產量及菇體品質，之後再大量製作菌種做為商業生產之用。

所謂「工欲善其事，必先利其器。」優良的菌種就是用以栽培菇類的利器，而良善的菌種保存方式就是這把利器的磨刀石。

文˙ 圖／陳美杏、李瑋崧、呂昀陞　農業試驗所植物病理組(豐年6703)