含蘇力菌毒素基因cry1Aa1之轉形葉表生菌Erwinia herbicola的殺蟲活性與質體留存之分析 - 農業知識入口網

葉表生菌Erwinia herbicola與大腸桿菌Escherichia coli同屬腸道科細菌，常見於蔬菜、果樹等植物葉面，對植物本身大多沒有毒性，同時會分泌抗生物質抑制火燒病（fire blight）病原菌Erwinia amylovora的生長，若將有效的抗蟲基因轉入，則可提高E. herbicola在經濟作物保護上的利用價值。我們利用菌種中心提供之E. herbicola ATCC 14589，以及由芥藍菜嫩葉上篩選出本土菌株 E. herbicola TC1與TC7作為基因轉形（transformation）之宿主，透過電穿孔轉形法將構築有蘇力菌（Bacillus thuringiensis）基因cry1Aa1的質體pUN4分別送入上述菌株，得到Eh4、Eh5與Eh6轉形株，並觀察cry1Aa1基因所表現蛋白質的殺蟲效果。Eh4、Eh5與Eh6的總蛋白質抽出物，在濃度為2.5 mg/ml下，餵食小菜蛾三齡幼蟲72小時後，幾乎可達到100 % 的死亡率，而在低濃度0.625 mg/ml下，仍分別達到80 %、94 %與42 %的死亡率；其中，Eh4、Eh5在更低蛋白濃度0.312 mg/ml下，仍可分別造成小菜蛾幼蟲死亡率達26 %與42 %。在殺蟲時效性的觀察方面，利用濃度為1.25 mg/ml之轉形菌株蛋白萃取物餵食，經48小時後，即可分別造成84 %、82 % 與52 %的小菜蛾幼蟲死亡，接近餵食半量濃度0.625 mg/ml在72小時後造成的死亡率，顯示提昇濃度可提前見效，有助於減少葉面遭受取食。另外在不含抗生素Ampicillin（Amp）的培養條件下，觀察質體pUN4在轉形的E. herbicola菌體中續存的狀況，以及調查轉形菌株在甘藍葉面上族群的穩定程度，有助於評估此基因轉形菌種在田間施用的可行性。在質體續存的探討上，在無Amp篩選壓力下培養Eh4或Eh6，發現含pUN4質體的菌數會在培養一天後開始減少，兩週內轉形菌數維持在 107－1010 CFU/ml，總菌數則保持在 1013 CFU/ml 左右，顯示轉形菌株雖會逐漸淘汰質體pUN4，仍在一定的培養天數內，達到繁殖數量上的平衡。在葉面菌株族群穩定度的調查上，將菌數106－107 CFU/ml的Eh4或Eh6均勻噴灑在甘藍菜的葉面上，逐日採取固定面積的葉片，計算葉面殘存的轉形菌株，發現一週後仍有104 CFU/ml，隨著時間菌數會逐漸下降，兩週後殘留的轉形菌株為102 CFU/ml，一個月後則完全測不到轉形菌株的殘留，而不含轉形質體的對照菌株，則仍可維持104~105 CFU/ml的菌數，此顯示將轉形菌株作為生物農藥施用於田間，可因缺乏維持質體的抗生素壓力，減少菌體內殺蟲成份之殘留，並降低轉形基因污染環境之發生機率。總之，利用葉面拮抗細菌E. herbicola表現蘇力菌殺蟲蛋白，以及轉形質體逐漸淘汰的特徵，將使葉表生菌成為一項具有環境保護的生物性農藥。