梨葉緣焦枯病病菌與其他寄主侷限導管細菌之親緣相關性及研發PCR鑑定技術 - 農業知識入口網

梨葉緣焦枯病(pear leaf scorch)為台灣特有之病害，亦為限制梨產業之重要病害，其病原菌為侷限導管細菌(xylem-limited bacteria; Xylella fastidiosa Wells)，為具有波浪狀細胞壁且歸類為不易培養之原核生物(fastidious prokaryrote)，過去研究顯示梨葉緣焦枯病菌與其他寄主之X. fastidiosa 菌株間為低血清相關性(serology relation)，同時X. fastidiosa專一性引子對272-int-1/272-int-2及RST31/RST33對國內各地梨葉緣焦枯病病菌菌株進行PCR反應，則無任何條帶產生，因此梨葉緣焦枯病病菌菌株與其他寄主之X. fastidiosa菌株間之親緣關係(phylogentic relationship)值得進一步釐清；利用ERIC-PCR、RAPD-PCR及BOX-PCR等技術分析國內各地之梨葉緣焦枯病病菌菌株及其他寄主之X. fastidiosa菌株之DNA，其他寄主植物包括夾竹桃(oleander)、胡桃(pecan)、李(plum)、桃(peach)、桑(mulberry)、葡萄(grapevine)及無花果(sycamore)，分析結果皆可將試驗菌株區分為兩大群，分別為梨菌株群與其他寄主之X. fastidiosa菌株群，其中其他寄主之X. fastidiosa菌群可以再分為三個菌群：(I)夾竹桃菌群、(II)胡桃、李、桃及無花果菌群及(III)桑及葡萄菌群；進一步進行16S rDNA及16-23S rDNA區間序列之分析，分別選殖得到特定核酸片段大小介於1537?1540bp及512?540bp，其中基因序列顯示梨葉緣焦枯病病菌菌株與其它寄主之X. fastidiosa菌株相似值分別介於0.982?0.987及0.874?0.876；利用由鄰聚法(neighbor joining)進行親緣相關性分析，由16S rDNA序列及16-23S rDNA區間序列所得親緣樹(phylogentic tree)皆可將菌株分為兩大群，分別為梨菌株群及其它寄主之X. fastidiosa菌株群。由指紋圖譜分析及特定核酸序列分析之結果，顯示梨葉緣焦枯病病菌菌株應為Xylella屬內獨立的菌株群，由此結果應可支持梨葉緣焦枯病菌菌株應為Xylella亞種以上分類地位，甚至可能為新種。為快速鑑別梨葉緣焦枯病菌菌株，利用OPA11隨機引子進行RAPD分析，成功篩選出梨葉緣焦枯病病菌獨有核酸片段大小為1412bp，進一步進行轉殖及序列解序，並設計得一組專一性引子對為PLS-F/PLS-R(5’- TGGACGTTGTGGTATCGG TG-3’/ 5’- TTGAAGTTGACGTGTGGCTG -3’)，此一引子可對梨葉緣焦枯病病菌增幅出416bp專一性產物片段，但其他寄主之X. fastidiosa菌株及其他對照一般病原細菌菌株之基因體核酸皆無法增幅產物片段，其靈敏度最高可以到10pg基因體核酸，並可直接進行田間罹病梨樹組織之檢測，此引子有潛力應用於偵測田間中間寄主植物及蟲媒之病原菌。
關鍵字：梨葉緣焦枯病、侷限導管細菌、親緣相關性、PCR鑑定技術