番茄‘花蓮亞蔬五號’以農桿菌法轉殖Bt基因之研究--材料與方法-2 - 農業知識入口網

四、DNA及RNA抽取
植株之葉片樣本均以液態氮降溫磨碎後再進行DNA及RNA抽取，微量DNA以DNeasy Plant kit（Qiagen）抽取DNA，抽取大量DNA採用Murray及Thompson（1980）以CTAB緩衝液抽取的方式，RNA則是以PineTree方式（Chang et al., 1993）抽取，純化之DNA、RNA經測定A260/A280 ratio確認比值，DNA在1.7-2.0之間，RNA在1.9-2.1之間為品質良好，DNA及RNA分別經Agarose電泳及formaldehyde denature agarose電泳確認條帶無誤後，分別置於-20℃及-80℃中保存以進行PCR檢測及南方、北方雜合分析。
五、PCR檢測
設計蘇力菌蛋白基因Cry1AC及Cry1IC之PCR引子：CryAC-F：5’-CAACAACTATCTGTTCTTGACGGGACA-3’CryAC-R：5’-CTTGATTGTAGATTATCTAATGACGTAGCTGTAGCT-3’CryIC-F：5’-CCTTTGGTGATTTTGTATCTCTACAAGTCAA-3’CryIC-R：5’-GAGGTTGTTCACTTATCCCAATTATATCTGGA-3’
進行聚合酶連鎖反應（PCR），每樣本反應總體積為20 μl，內含一組兩個10 μM引子0.6 μl，番茄DNA 0.1 μg，2.5 mMdNTP 4 μl、PCR 10X buffer 2 μl、Taq DNA Polymerase 1 unit，以PCR反應器9700（ABI公司，美國）進行PCR反應。反應步驟為：起始變性溫度為94℃5 min；變性溫度94℃40 sec，煉合溫度55℃40 sec，延展溫度72℃40 sec，循環35週期；最後延展溫度72℃7 min。取10 μl PCR產物與2 μl 6X Loading Dye混合，注入於含1.5%（w/v）agarose及1倍SYBER SAFE（Invitrogen公司，美國）之1 X TAE緩衝液膠體，在100 V電壓下進行電泳解析，25 min後取出膠體，置於紫外燈下觀察結果。