番茄‘花蓮亞蔬五號’以農桿菌法轉殖Bt基因之研究--材料與方法-3 - 農業知識入口網

六、南方式雜合檢測
擬轉殖番茄及對照植株葉片DNA 20 μg分別以三種限制酵素AvaI、NcoI及EcoRI酶切16 hr後，分別注入1%（w/v）agarose之1 X TAE緩衝液膠體，電泳14 V 20 hr後，進行轉漬，參照王和林（2007）之實驗步驟。
雜合前先製作DIG探針，利用DIG探針製作套組（Roche公司），利用已確定序列之Bt基因DNA當作模板，以PCR的方式將DIG-dUTP結合在DNA探針上，探針製作完成後可貯存於-20℃保存。
將轉漬膜與預雜合緩衝液放置於雜合管中，再置於雜合箱中42℃預雜合反應1 hr，雜合前取2 μl探針與8 μl無菌水混合，經100℃5 min將DNA探針雙股分開，再置於冰上5 min。預雜合反應完畢後將預雜合緩衝液倒掉，再加入含有已分開雙股的探針雜合之緩衝液，在42℃中雜合反應隔夜，第二天取出轉漬膜於室溫下以2X SSPE緩衝液+0.1％SDS溶液60 rpm震盪清洗10 min 2次，再置於65℃下0.5X SSPE緩衝液+0.1％SDS溶液震盪清洗15 min 2次。再按照Roche公司出版的DIG應用步驟，經清洗、blocking、與抗體結合、清洗兩次後以CDP-STAR與抗體反應，與探針結合之DNA條帶反應後會放出化學冷光，冷光顯影結果以LAS4000冷光照像機（富士公司，日本）紀錄。
七、北方雜合檢測
取番茄葉片RNA 20 μg以含1%（w/v）agarose（含formaldehyde）於MOP緩衝溶液中以50 V電泳分離1 hr後，放入20X SSC緩衝液平衡15 min 2次，再進行轉漬之後之實驗（如南方雜合步驟），但雜合條件為50℃反應隔夜。