因應氣候變遷發展之農業技術-植物種原超低溫冷凍保存技術簡介(上).pdf - 農業知識入口網

作物種原
因
因應氣候變遷發展之農業技術-
應
氣
候
超低溫冷凍保存技術
植物種原 簡介
(上) 變
遷
發
農試所嘉義分所陸柏憲賴永昌 展

之
一、前言 農
業
全球氣候變遷的影響日益加劇，極端氣候如強烈颱風、超大豪雨、熱浪等天然
技
災害頻仍，對全球農糧產業發展造成嚴重衝擊。近年台灣面臨罕見霸王寒流、最暖 術
︱
冬季，及夏季無颱所致的嚴重旱災，使全台農業生產連年遭受重創。因此，發展農
植
物
業調適技術解決氣候變遷之危機已是當務之急。氣候變遷對於植物多樣性的影響
種
特別嚴重，若不積極進行植物種原收集與保存恐使珍貴種原流失。超低溫冷凍保存 原
超
係指將材料保存於冷凍狀態，為進行種原長期保存的理想方法。目
(cryopreservation) 低
前植物種原超低溫保存技術逐漸成熟，國際間各種原保存機構已開始實際應用於保 溫
冷
種任務上。為因應氣候變遷造成物種滅絕之危機，建立超低溫冷凍保存技術有其發展
凍
潛力。本文分上篇簡介氣候變遷下種原保存之重要性、超低溫冷凍保存的基本原理； 保
存
下篇簡介超低溫冷凍保存的研究歷程及各國機構應用情形，期有助於台灣在植物遺 技
術
傳資源保存領域的發展，及實務應用上之參考。
簡
介
二、種原保存之重要性及慣行方式簡介 ︵
上
氣候變遷會影響原有地理環境的氣候變化，使物種分布發生改變，增加病蟲害風
︶
險，以及外來種入侵危機，進而導致原有物種消失與滅絕，因此，加強物種的收集與
保存，維護生物多樣性，已是全球生態保育和農業永續發展的重要課題。農業試驗所
於 年落成啟用國家作物種原中心，結合嘉義與鳳山兩分所，迄今已保存超過 萬
1993 24
份的作物種原收集系 表一。
(accessions)( )
植物種原 係指活體植物之遺傳資源 ，其形態小
(plant germplasm) (genetic resources)
至花粉、種子、組織，乃至完整植株。凡帶有植物遺傳訊息 基因 的活體材料皆可收
( )
集做為種原。此外，從自然環境收集的植物種原往往帶有適應逆境的優良基因，可供
作為耐逆境育種研發的重要材料。
由於作物育種技術日益精進，持續選育新品種而大面積推廣，加之企業化的耕
作型態，致使作物栽培品種之選擇趨於一致。單一化的品種栽培模式導致具優良適
作 者：陸柏憲助理研究員
連絡電話：05-2753182
－農業試驗所技術服務季刊．2022年3月．129期－ 27作物種原
因 應性及耐逆境的地方品種 、野 原滅絕機率高，原地保存難以施行時，
(landraces)
應
氣 生近緣種(wild relatives)、雜草型種(weed 則可將種原帶離原生育地，遷移至另一
候
等種原不斷流失。在物種內遺傳 環境集中管理，如設立植物園或保種中
races)
變
遷 多樣性的急遽減少之下，使主要栽培品 心，稱為異地保存(ex situ conservation)。
發
種對於氣候變遷之威脅產生遺傳脆弱性 原地和異地保存主要於野外、田間進行
展
之 ，一旦面臨災害性 保存作業，需利用大面積的土地及大量
(genetic vulnerability)
農
的逆境，將造成作物產量損失，嚴重乃 人力資源，且所保存之種原易受外界環
業
技
至植株死亡。 境影響，若遭逢災害性之極端氣候，極
術
︱ 現階段國內、外慣行的種原保存方 易使種原滅絕流失。
植
式眾多，而依材料保存的型態可區分成 (二)體外保存：指透過植物組織培
物
種 體內保存(in vivo conservation)與體外(離 養(tissue culture)技術進行種原保存，可
原
超 體)保存(in vitro conservation)： 克服體內保存之缺點。利用種原細胞、
低 (一)體內保存：指遺傳訊息保存於 分生組織或器官，以無菌培養方式保存
溫
冷 完整且存活的植株個體內。如維護原有 於密封試管中，隔絕外界不利環境；由
凍
的生態環境，設立自然保護區或國家公 於植物細胞具細胞全能性 ，
(totipotency)
保
存 園，讓物種在原生地自然生長繁衍，可 在適當光照、溫溼度及培養基的調節
技
術 稱為原地保存(in situ conservation)；當種 下，遺傳資源可持續繁殖保存於試管
簡 中，特別適合無性繁殖作
表一、國家作物種原中心種原保存量統計
介
︵ 收集系 物(圖一)。雖然體外保存
上 地點 (Accessions) 備註
所需材料體積較小，具節
︶ 數量/份
1. 農試所低海拔種原保存園 340 果樹 省空間、利於運輸交換等
2. 農試所中海拔種原保存園 127 果樹 優勢，且於無病原體的環
3. 農試所高海拔種原保存園 25 果樹
境中免受自然環境危害；
4. 農試所無性繁殖作物田間保存園 634 觀賞及木本植物
然其需花費人力、物力進
5. 鳳山分所熱帶果樹保存園 416 熱帶果樹
6. 嘉義分所熱帶及亞熱帶果樹保存園 833 熱帶及亞熱帶果樹 行週期性的繼代培養為
7. 關西工作站 192 柑橘 其缺點，無法進行長期保
8. 花卉研究中心 423 花卉 存，且繼代過程中可能發
9. 種子中期庫 71,985 種子
生種原突變 、褐
(mutation)
10. 組織培養庫(農試所) 412 植物組織
化 或汙染之風
11. 組織培養庫(嘉義分所) 1,713 植物組織 (browning)
12. T-DNA T1 種子庫 85,899 水稻種子 險。
13. T-DNA T2 種子庫 84,503 水稻種子 值得注意的是，超低
合計 247,502 溫冷凍保存係指將材料保
資料來源：國家作物種原中心種原保存及種子與種苗國際交換年報。
存於極端低溫下，是一種
製表日期：2019 年01 月
28 －農業試驗所技術服務季刊．2022年3月．129期－作物種原
進階體外保存種原的技術 圖二 ，可克 不同學者研發的步驟稍有不同，至 因
( )
應
服目前慣行種原保存的缺點，國際上視 今已發表數種超低溫冷凍保存方法(圖 氣
候
為植物種原長期保存的理想方法。目前 三 ，各有其特色及優缺點，然其基本
)
變
各國種原保存機構在根莖類、蔬菜、果 流程可統整如圖三所示。首先需建立種 遷
發
樹、花卉等作物種原中皆有實際應用， 原離體材料，材料型態因不同物種特性
展
且正積極研發不同作物之凍存技術，可 而異，如禾本科利用花粉，無性繁殖作 之
農
謂未來種原保存技術的發展趨勢。 物利用莖頂、根尖組織，果樹作物則多
業
技
以休眠芽或枝條。在多數溫帶作物中，
三、超低溫冷凍保存基本原理 術
由於其耐寒性、休眠性與低溫適應性較 ︱
及流程
植
佳，比起熱帶或亞熱帶作物，溫帶作物
超低溫冷凍保存可利用之材料，包 物
種
含植物花粉、莖頂和根尖分生組織、
原
懸浮細胞、種子、休眠芽及枝條等， 超
低
其優點為材料體積較小，可節省保存 溫
冷
空間，且不受環境因子如氣候、病原
凍
菌干擾。此外，進行超低溫冷凍保存 保
存
時植物細胞停止生長，可省略週期性
技
繼代培養，降低人力成本，減少種原 術
簡
突變、人為汙染之疑慮。然其缺點在 介
︵
於電力或冷源供應一旦中斷 如戰爭
(
上
或天災)，則可能致使保存材料一夕 ︶
之間全毀。
圖一、甘藷種原離體保存。
一般進行超低溫冷凍保存所使用
之冷源包含：固態二氧化碳 ℃ 、
(-79 )
超低溫冷凍櫃 ℃ 、液態氮蒸氣相
(-80 )
℃ 及液態氮 ℃ ，而又
(-140–-180 ) (-196 )
以液態氮使用最為廣泛。當植物細胞
經適當處理程序後，置於極端低溫環
境，細胞分裂和生理代謝反應受到抑
制，生命現象幾近靜止狀態，但仍能
保持穩定不至死亡；當外界環境恢復
時，植物細胞又可復原，保持正常生
理活性、型態發生 潛
(morphogenesis)
能及維持遺傳穩定性。 圖二、種原進行超低溫冷凍保存。
－農業試驗所技術服務季刊．2022年3月．129期－ 29作物種原
因 的超低溫冷凍保存較容易成功。 存後存活率。甘油、乙二醇與二甲基亞
應
氣 此外，欲進行超低溫冷凍保存之材 碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)為較常使用
候
料，其年齡及尺寸選擇亦為重要因素， 的抗凍劑，惟 對細胞具有毒性及
DMSO
變
遷 因其關係至凍存後存活率與再生能力之 高滲透濃度，添加時需控制濃度及處理
發
表現。以莖頂組織為例，材料年齡範圍 時間，以免毒害細胞。
展
之 多為繼代培養 週至 個月間，其中又以 材料完成抗凍處理後，即置入冷源
1 3 2
農
至 週之材料較常使用；材料尺寸範圍則 中進行保存。當有繁殖或試驗需求時再
業 8
技
多介於 之間，而以 之尺 將種原取出，經過回溫、回復生長後，
0.5–3 mm 1–2 mm
術
︱ 寸應用較廣。值得注意的是，即使為保 即可再生成完整植株。根據Tanaka et al.
植
存相同物種，最佳的材料年齡及尺寸仍 研究報告指出，降溫及升溫處理速
物 (2018)
種 會因不同品種 基因型 而異，因此建立 率因不同凍存方法而異，傳統慢速冷凍
( )
原
適當離體材料為超低溫冷凍保存的初步 之降溫速率約 ℃ ；隨凍存技術
超 0.1–4 /min
低 要點。 發展，降溫速率可達 ℃ 、回
100–200 /min
溫
冷 為 使 材 料 進 行 抗 凍 保 護，需 溫速率達80–140℃/min；而新興研發之
凍
將材料進行預處理，如冷馴化 凍存技術效率更佳，降溫速率可達
(cold 4000–
保
存 、預培養 、添加 ℃ 、回溫速率可達 ℃
acclimation) (pretreatment) 5000 /min 3000–4500 /
技
抗凍劑 等，避免冷凍過程中細 。
術 (antifreeze) min
簡 胞內水分結冰造成機械傷害，以提高凍 最重要的關鍵點是，材料於凍存後
介
︵ 是否可恢復活性及再生能
上
力，才能發育成完整植株供
︶
後續種原利用。為提高存活
率和再生率，材料於回復
生長階段需先行暗 或低照
(
度 處理數日，再移至正常
)
光照環境 光 暗 ；
(16 hr –8 hr )
並於回復培養基中添加醣
類 蔗糖 、營養元素及植物
( )
生長調節劑 、 、
(IAA BA GA
3
等 ，以利種原恢復正常生
)
長發育。最終，可用多種分
子標誌檢測凍存後之再生
植株，以確保種原材料的
圖三、超低溫冷凍保存基本流程圖。圖片來源：修改自
遺傳穩定性。待續
Normah et al. (2019)。 ( )
30 －農業試驗所技術服務季刊．2022年3月．129期－