因應氣候變遷發展之農業技術-植物種原超低溫冷凍保存技術簡介(下).pdf - 農業知識入口網

b"作物種原
因
因應氣候變遷發展之農業技術-
應
氣
候
超低溫冷凍保存技術
植物種原 簡介
變 (下)
遷
發
展 農試所嘉義分所陸柏憲賴永昌

之
農 接續上篇
( )
業
技
四、超低溫冷凍保存方法與研發歷程
術
︱
植物超低溫冷凍保存的研究發展，最早可追溯至 的研究，其利用程序
Sakai(1960)
植
物 冷凍器(programmable freezer)控制降溫速率，將耐寒木本植物枝條預冷凍至-30°C，
種
再浸入液態氮中，並於 ° 下緩慢解凍，結果成功保持枝條活性。於接下來的 年
原 0 C 30
超 間，傳統超低溫冷凍保存技術如 、 的研發進展，可成功
Slow freezing Two–step freezing
低
應用於癒傷組織、懸浮細胞及耐寒物種的保存。植物低溫生物學的研究於 年代發
溫 1990
冷
展迅速，推動以材料脫水 、玻璃質化 為基礎的超低溫冷凍保存技
(dehydrated) (vitrified)
凍
保 術興起，如玻璃質化法(vitrification)、包埋脫水法(encapsulation–dehydration)及藻膠包
存
埋玻璃質化法 等。其優點在於材料經冷凍保護處理後可直
技 (encapsulation–vitrification)
術 接浸入液態氮中，無需控制降溫速率，適用於懸浮細胞、莖頂組織等材料，三種常見
簡
方法簡介如下：
介
︵ 一 玻璃質化法：材料首先加入高濃度冷凍保護劑，使細胞水分於低溫下固化成
( )
下
︶ 玻璃態(glass state)，避免冰晶產生。冷凍保護劑以高滲透性的PVS2(plant vitrification
使用最為廣泛。由於冷凍保護劑的滲透濃度高，長時間處理將毒害細胞，因
solution 2)
此調控處理濃度及時間為提高材料存活率之關鍵。
二 包埋脫水法：材料先以藻膠 海藻酸鈉 包覆，並以蔗糖填充
( ) ( , sodium alginate)
處理，置於無菌操作台脫水風乾，再以液態氮凍存。此法優點為僅用蔗糖做
(loading)
冷凍保護劑，不經 處理，可避免玻璃化液對材料造成傷害，然而處理步驟繁瑣、
PVS2
風乾時間較長為其缺點。
三 藻膠包埋玻璃質化法：結合上述兩法而衍生，材料以藻膠包埋後加入 ，
( ) PVS2
再置入液態氮凍存。此法較包埋脫水法有較高存活率，且可節省風乾脫水之時間，但
處理步驟較為繁複；而因材料不直接觸及抗凍劑，可減輕材料所受傷害。嘉義分所
亦利用此法成功進行馬鈴薯超低溫冷凍保存 圖四，試驗結果顯示凍存後存活率可達
( )
作 者：陸柏憲助理研究員
連絡電話：05-2753182
20 －農業試驗所技術服務季刊．2022年6月．130期－作物種原
以上，且存活培植體可再生成完整 法及 法。兩法操作流 因
因應氣候變遷發展之農業技術- 70% plates D cryo–plates
應
植株。 程相近，材料置於鋁片上凹槽再以藻膠 氣
候
等學者 發表液滴玻璃質 包覆材料。於脫水階段， 法
Panis (2005) V cryo–plates
變
化法(droplet–vitrification)，於超低溫冷凍 利用PVS2；D cryo–plates法利用風乾方 遷
發
保存的研究歷程中立下新的里程碑。材 式，最後保存於液態氮中。此技術優點
展
料處理同於前述玻璃質化法，但操作過 在於材料固定於冷凍鋁片上，減少材料 之
農
程中材料置於鋁箔條 受傷或損失的比率，且降溫和回溫速率
(aluminum foil strips, 業
技
× 圖五 上，且僅使用一滴冷 極高，可增加材料凍存後存活率。
5 20 mm)( A)
術
凍保護劑(約15 μl)，再將鋁箔條放入液 另外，由Funnekotter等學者(2017) ︱
植
態氮中保存。此法由於冷凍保護劑的體 發表以不鏽鋼網條
(stainless steel mesh 物
積小，且直接浸入液態氮中，材料於鋁 圖五 為基礎的 法，為 種
strip) ( C) cryo–mesh
原
箔條上達極高之冷凍速率，可顯著提高 近年超低溫冷凍保存研究取得新進展。
超
材料凍存後之存活率，目前各種原保存 材料固定於不鏽鋼網條 × 孔 低
(25 7 mm,
溫
機構多採用此法進行種原長期保存。 距0.4 mm, 線徑0.224 mm)上進行操作。 冷
凍
玻 璃 質
保
化法操作中 存
技
材料需不停
術
反 覆 移 動， 簡
介
易造成材損 ︵
下
傷 和 遺 失，
︶
等
Yamamoto
學者
(2011)
馬鈴薯
設計帶有凹
超低溫
槽的冷凍鋁 冷凍保存
片
(aluminum
cryo–plates,
× ×
7 37 0.5
以固定材
mm)
料 圖五 ，
( B)
衍生以冷凍
鋁片為基礎的
凍存技術，分 圖四、應用藻膠包埋玻璃質化法進行馬鈴薯超低溫冷凍保存。A:建立馬鈴薯離
體材料。B:進行藻膠包埋。C:進行抗凍保護處理。D:超低溫冷凍保存。E:材料進
別為
V cryo–
行回復培養。F:成功再生成完整植株。
－農業試驗所技術服務季刊．2022年6月．130期－ 21作物種原
因 學者成功利用 法進行袋鼠爪 一 國際馬鈴薯中心
cryo–mesh ( ) (International Potato
應
氣 草(Anigozanthos viridis)的超低溫冷凍保 Center, CIP)，主要負責收集保存甘
候
存，為未來作物種原長期保存的利用提 藷、馬鈴薯及安地斯根莖類(Andean
變
遷 供新方向。 roots and tubers)等種原。CIP保存超
發
過 份種原收集系，其中約
展 五、全球種原保存機構應用情 11,000 4,500
之 份以離體方式進行保存。自 年
形簡介 2013
農
起， 開始應用液滴玻璃質化法進
業 CIP
全球各大洲皆設有種原保存機構，
技
行超低溫冷凍保存，且預計逐年增
術 除進行原地及異地保存外，尚建立體外
︱ 保存基因庫(in vitro gene bank)做為安全 加400份馬鈴薯種原，CIP的超低溫
植
基因庫迄今已保存 份馬鈴薯與
物 備份，避免不利因子影響，維持遺傳資 4,068
種 份甘藷種原。
源穩定性。然而，實際應用超低溫冷凍 324
原
二 國際熱帶農業研究所
超 技術進行長期保存的機構不多，僅少數 ( ) (International
低
國家擁有超低溫基因庫 。 Institute for Tropical Agriculture,
溫 (cryogene bank)
冷 根據 等學者 報告，全球 個 IITA)，收集保存非洲主要糧食作物
Acker (2017) 15
凍
種原保存機構中，田間保存方式占比最 種原，包含豇豆、樹薯、香蕉、山
保
存 高 ，離體保存次之 ，而超低 藥、大豆、玉米及班巴拉花生等，
(66%) (46%)
技
術 溫冷凍保存僅占16%。就作物別而言， 總計超過35,000份種原收集系。自
簡 應用超低溫冷凍保存佔比最高之前三項 2017年開始，IITA已應用液滴玻璃
介
︵ 作物分別為馬鈴薯(38%)、樹薯(22%)及 質化法進行樹薯種原保存。IITA的
下
桑樹(12%)，可見國際間對於超低溫冷凍 超低溫基因庫預計於2022年保存
︶
保存之應用仍有大幅發展空間。以下簡 份樹薯及 份山藥種原。
1000 500
介全球各機構種原收集之作物類別及超 三 國際運傳中心
( ) (International Transit
低溫基因庫應用情形(表二)： Centre, ITC)，收集保存超過1500種
可食用及野生種芭蕉
屬(Musa spp.)種原，為
全球香蕉遺傳多樣性
最豐富的機構之一。
主要利用田間、體
ITC
外保存方式進行芭蕉
屬的種原保存，其中
約有 種已利用液
1100
滴玻璃質化法進行超
圖五、不同種類的冷凍鋁片。A：鋁箔條。B：冷凍鋁片。C：不鏽鋼網
低溫冷凍保存。
條。圖片來源：Wang et al. (2020)。
22 －農業試驗所技術服務季刊．2022年6月．130期－作物種原
四 國際熱帶農業中心 所屬系 因
( ) (International Research Service, USDA–ARS)
應
Center for Tropical Agriculture, 統，負責美國重要農業植物遺傳多 氣
候
，迄今保存 份菜豆屬 樣性之保存及利用。 迄今已保
CIAT) 37,938 NPGS
變
(Phaseolus)、22,694份熱帶飼料作物 存244科，2,554屬，16,163種，總計 遷
發
豆科、牧草 及 份樹薯等種原， 近 萬份作物種原。於超低溫基因
( ) 6,155 60 展
其中樹薯以田間及體外保存為主。 庫方面， 保存近 份種原包 之
NPGS 4,000
農
已凍存超過 份樹薯核心種原 含大蒜、草莓、甘藷、馬鈴薯、薄
CIAT 480 業
技
，主要以液滴玻璃質 荷、櫻桃、梨及蘋果等，凍存方法
(core collection)
術
化法及包埋脫水法為主，而近期朝 則以液滴玻璃質化法(莖頂組織)及 ︱
植
樹薯野生近緣種之凍存技術發展。 緩慢冷凍法 果樹休眠芽 為主。
( ) 物
五 國家植物種原系統 六 萊布尼茨植物遺傳與作物研究所 種
( ) (National Plant ( )
原
，為美國
Germplasm System, NPGS) (Leibniz Institute of Plant Genetics and 超
農業部 農業研究局 ，已保存 低
– (United States Crop Plant Research, IPK) 776
溫
Department of Agriculture–Agricultural 屬，2,933種，總計近15萬份種原。 冷
凍
之 種
表二、國際種原保存機構應用超低溫冷凍保存之主要作物、保存數量及方法 I P K 保
保存數量 原 皆 以 乾 存
國家 機構名稱 主要作物 z 方法 技
(accession) 燥 種 子
術
祕魯 國際馬鈴薯中心(CIP) 馬鈴薯 4,068 液滴玻璃質化法 型 態 保 存 簡
甘藷 324 液滴玻璃質化法 介
奈及利亞 國際熱帶農業研究所(IITA) 樹薯、山藥 (試驗中) 液滴玻璃質化法 於-18℃， ︵
下
比利時 國際運傳中心(ITC) 芭蕉屬 ~1,100 液滴玻璃質化法 而 無 性 繁 ︶
哥倫比亞 國際熱帶農業中心(CIAT) 樹薯 ~480 液滴玻璃質化法 殖 作 物 以
大蒜、草莓、甘藷、馬
液滴玻璃質化法、 離 體 保 存
美國 國家植物種原系統(NPGS) 鈴薯、薄荷、櫻桃、梨 ~4,000 緩慢冷凍法
及蘋果
為主。目前
馬鈴薯 1,818 液滴玻璃質化法
萊布尼茨植物遺傳與 IPK的超低
德國 作物研究所(IPK) 薄荷 157
溫 基 因 庫
蔥屬 213 玻璃質化法
蔥屬、馬鈴薯、百合 已 保 存 超
國家農業生物多樣性 液滴玻璃質化法、
南韓 中心(NAC) 屬屬、、蘋草果莓屬、甘藷、菊 1,558 緩慢冷凍法 過2100份
桑樹 1,283 緩慢冷凍法 種原，包含
日本 遺傳資源中心(NGRC) 馬鈴薯 310 份馬鈴
1818
藺草 181 V cryo–plates法
薯、 份
157
國家植物遺傳 液滴玻璃質化法、
印度 資源局(NBPGR) 桑屬、芭蕉屬、蔥屬 ~10,000 緩慢冷凍法 薄 荷 、 及
資料來源:各機構發表之研究報告、年報、數據庫及官網公告內容，筆者統整製表(製表日期:2022年2 份蔥屬
213
月)。
等
z (Allium)
保存數量為製表日期當月數據，惟即時保存數量可能因各機構研發進展而變動。
－農業試驗所技術服務季刊．2022年6月．130期－ 23作物種原
因 作物，主要凍存方法為液滴玻璃質化 原保存數量最豐富的機構之一，僅
應
氣 法及玻璃質化法。 次於美國NPGS。目前已收集種原涵
候
(七) 國家農業生物多樣性中心(National 蓋812屬，2,020種，包含禾穀類、豆
變
遷 ，為 科、蔬菜、果樹、纖維料、飼料、藥
Agrobiodiversity Center, NAC)
發
展 韓國農村振興廳(Rural Development 用及辛香料作物等，總計近40萬份
之 Administration, RDA)所屬單位。 種原；而目前NBPGR的超低溫基因
農
業 NAC目前保存農園藝、特用及飼料 庫中已保存近1萬份種原收集系，主
技
作物種原之種子24萬份、無性繁殖 要為桑屬(休眠芽)、芭蕉屬及蔥屬
術
︱ 作物達26,000份。NAC的超低溫基 (液滴玻璃質化法)作物。
植
因庫自 年起陸續保存 種作物種
物 2006 7 六、結語
種 原，目前已達 份 包含 份蔥
1,558 ( 1,104 種原收集與保存是農業調適技術
原
超 屬、68份馬鈴薯、196份百合屬、48 中關鍵的一環，現行方法多以田間、離
低
份蘋果屬、 份甘藷、 份菊屬及
溫 36 86 體保存為主，僅可作短(中)期保存。而
冷 份草莓。
20 ) 超低溫冷凍技術可保存小體積材料，節
凍
八 日本國家農業與食品研究機構
保 ( ) 省人力及空間，避免外界環境危害，並
存
(National Agriculture and Food 保持高度遺傳資源穩定性，為種原長期
技
術 Research Organization, NARO)所 保存的理想方法。目前國際間種原保存
簡
屬遺傳資源中心
介 (NAROs Genetic 機構皆有應用實例，且凍存種類及數量
︵ ，迄今保
Resources Center, NGRC) 將逐年增加，積極開發不同作物的凍存
下
存近 萬份種原，包含禾本科、豆
︶ 23 技術為未來發展趨勢。就現階段之進展
科、根莖類、飼料、蔬菜、果樹、花
而言，多以溫帶作物有較多成功案例，
卉等，主要透過種子儲藏；其中近
3 而熱帶或亞熱帶作物因植物本質較不耐
萬份種原為無性繁殖作物，主要利
低溫，存活率普遍偏低，仍有待進一步
用田間及離體保存。目前NGRC的超 突破。台灣因氣候及地理環境特殊，擁
低溫基因庫中保存1283份桑樹種原 有豐富的熱帶及亞熱帶作物種原，可針
(休眠芽)、310份馬鈴薯、181份藺草 對此項優勢加強相關作物凍存技術的研
(mat rush)等作物，主要利用緩慢冷 究。參閱目前國內有關超低溫冷凍保存
凍法及V cryo–plates法。 的文獻，台灣在林木、藥用、蘭花、無
(九) 國家植物遺傳資源局(National Bureau 性繁殖等作物上已有諸多成果，顯示台
of Plant Genetic Resources, NBPGR)， 灣在此領域的研發上已奠定穩固基礎，
為印度農業研究委員會(Indian 未來如何參考各國經驗，實際建立超低
Council of Agricultural Research, 溫基因庫，應用於種原保存的任務上，
ICAR)所屬單位。NBPGR為全球種 為台灣下一階段需努力的目標。
24 －農業試驗所技術服務季刊．2022年6月．130期－"