當歸、丹參萃取物對抑制癌細胞之影響--材料與方法-2 - 農業知識入口網

二、當歸與丹參萃取物對抑制癌細胞之影響
（一）細胞株與培養條件：本試驗所使用的癌細胞株，包括人類乳癌細胞(MCF-7)、人類肝癌細胞(MSG2)、人類肺癌細胞(A549)以及人類肝癌細胞(HepG2)等四種細胞，其中MCF-7、MSG2、A549等細胞株是由慈濟大學陳紀雄教授所提供，而HepG2則由慈濟大學羅時燕教授所提供。細胞培養於含10% 胎牛血清( FBS, Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel)、100 U/ml penicillin及100 µg/ml streptomycin (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel)之Dulbecco's modified Eagle's medium with phenol red (DMEM, Gibco, New York, USA) 培養液，培養在37 ℃、5% CO₂培養箱中。
（二）細胞存活率測定：以WST-1 (4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio] -1,3-benzene  disulfonate)細胞增殖與細胞毒性測定法(Roche Co., South San Francisco, USA)來計算細胞存活率，其tetrazolium會被活細胞的粒線體脫氫酶(mitochondria dehydrogenases)還原生成紫色的formazan，細胞增殖越多，則顏色越深；若細胞毒性越大，則顏色越淺。為進行細胞生長測定，在96 wells培養盤中，每個well種約1× 104個細胞，並在上述相同條件下培養細胞隔夜，使細胞附著在每個孔槽底部，以當歸萃取物、丹參萃取物、前二者混合處理以及與順鉑藥物聯用等處理方式，當歸使用濃度為28.6-457 μg·ml^-1，丹參使用濃度為2-40 μg·ml^-1，順鉑使用濃度為0.2-5 μg·ml^-1，處理60 hr。對照組是以相同濃度的DMSO處理。處理後，除去培養基，以200 μl的1×  PBS (phosphate buffer saline)清洗，加入含有10 μl WST-1 cell proliferation reagent和190 μl phenol red free DMEM的混合液，在上述相同培養條件下靜置30 min，使細胞與試劑作用後，再以microplate reader (Thermo Scientific Multiskan Spectrum, New York, USA)在450 nm讀取吸光值。所有實驗均進行至少三次、每種濃度重複四次。計算細胞存活率的公式為：細胞存活率(%)=實驗組的OD值/對照組的平均OD值）×100。