細菌性軟腐病菌之拮抗菌篩選及其病害防治效果評估--06
四、拮抗菌鑑定
分子鑑定以 DNA 解旋酶次單元體 B 基因(gyr B) 之引子對 gyr B - F (5'- GAAGTCATC ATGACCGTTCTCCA -3') 與gyr B - R (5' -CCAAGACCTTTGTAACGCTG - 3') 進行增幅,反應條件設定為 95°C 變性(denaturing)2 min 後,30 次循環反應如下:95°C 變性 1 min,55°C 黏合(annealing)30 s,72°C 延長(extension)1 min;最後以 5 min 72°C 延長反應,反應後以 1 % 瓊脂膠進行膠體電泳。將 PCR 產物進行定序,結果資料利用 NCBI 的 BLAST 資料庫比對菌株,並以 MegAlign 建構親緣關係樹。為了確定 HL_B01 具甲基營養型芽孢桿菌之 methanol dehydrogenase structural 基因(McDonald and Murrell, 1997 ), 可 轉 化 甲 醇 後 以 其 為 唯 一 碳 源 生 長 , 於 此 利 用 專 一 性 引 子 對 mxaF - F (5'- GCGGCACCAACTGGGGCTGGT- 3') 及 mxaF - R (5' - GGGCAGCATGAAGGGCTCCC- 3') 進行檢測。
PCR 反應條件設定為 95°C 變性(denaturing)1 min 後,接著 40 次循環的反應如下:95°C 變性 1 min,60°C 黏合(annealing)30 s,72°C 延長(extension)1 min 30 s;最後加上 5 min 72°C 的延長反應,結束後以 1%瓊脂膠進行膠體電泳,確認是否具有條帶。
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