細菌性軟腐病菌之拮抗菌篩選及其病害防治效果評估--07
五、拮抗菌株生理生化測試(Madhaiyan et al., 2010)
生化分析之碳利用特性實驗中,分別使用HiMedia Laboratories 所設計之Phenol Red Broth(Proteose peptone 10 g/L、Beef extract 1 g/L、Sodium chloride 5 g/L、Phenol red 0.018 g/L,pH(at 25℃)7.4±0.2),進行 Arabinose、Inositol 以及 Inositol 的代謝測試(分別加入 5 g/L)。Nitrate Reduction 的測試以 Sigma-Aldrich 公司的方法進行:先配置Nitrate Broth(Peptone 5 g/L、Meet extract 3 g/L、Potassium nitrate 1 g/L,pH(at 25℃)7.0±0.2),接入 HL_B01 後於 30℃下培養 24-48 h,並加入 5 滴試劑 A(Sulfanilic acid)以及試劑B(N,N-Dimethyl-1-naphthylamine),充分搖動試管以將試劑與培養基混合。如果懸浮液變成粉紅色,則代表反應是正的。如果在添加試劑A 和B 後懸浮液是無色的,則加入少量鋅粉到養液中,劇烈搖動後使其在室溫下靜置 10-15 min,如果仍保持無色,則測試結果為正。尿素利用及溶血活性測試,即以 CMP® PPM 所出產的尿素(Urea Agar Slant)及血液培養基(Blood agar plate),測試 HL_B01 是否具有代謝尿素以及溶血的能力。另外,因 B. methylotrophicus 具以甲醇作為唯一碳源之特性,使用 AMS(K2HPO4 0.7 g/L, KH2PO4 0.54 g/L, MgSO4 · 7H2O 1.0 g/L, CaCl2 · 2H2O 0.2 g/L, FeSO4 · 7H2O 4.0 mg/L, NH4Cl 0.5 g/L, ZnSO4 · 7H2O 100.0 mcg/L, MnCl2 · 4H2O 30.0 mcg/L, H3BO3 300.0 mcg/L, CoCl2 · 6H2O200.0 mcg/L, CuCl2 · 2H2O 10.0 mcg/L, NiCl2 · 6H2O 20.0 mcg/L, Na2MoO4 · 2H2O 60.0 mcg/L, Agar 15.0 g/L )為基底,再混入 1%的甲醇,觀察 HL_B01 是否會在其中生長,以鑑定HL_B01 是否具有代謝甲醇的能力。另於生理耐鹽性試驗及生長溫度範圍測試中,分別利用 LB 為基底,分別配置 0%、1%、2%、3%、5%及 10%(w/v)鹽度的培養液,進行鹽度的耐受性測試。另外,生長溫度試驗是將菌株畫到 NA 平板上之後,放入 50℃的生長箱,3d 之後觀察其是否有生長。以上 HL_B01 之生理生化測試實驗中,皆以食工所標準菌株 B. methylotrophicus(BCRC 80285)及 B.amyloliquefaciens(BCRC 11557)作為對照菌株。
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