鐵炮百合癒傷組織再生系統應用於基因轉殖之研究初報－材料與方法 - 農業知識入口網

材料與方法
一、百合癒傷組織之誘導與植株再生系統之建立
(一)鐵炮百合胚珠培養與癒傷組織之誘導
以台灣原生的鐵炮百合(Lilium longiflorum Thunb.)為材料，依據蔡、林(1996)敘述之方法，並採用其培養基配方。在百合花開時進行自交授粉，授粉完後7至10天，取下子房進行子房橫切片培養；7週之後再取出膨大之胚珠，進行胚珠培養。再經過一段時間培養之後，胚珠表面長出癒傷組織，每一團癒傷組織各別單獨編號繼代培養；選取生長活力旺盛之癒傷組織團塊，進一步大量繁殖，以建立癒傷組織循環再生系統。
(二)百合花部組織之培養與誘導產生癒傷組織
材料為台灣原生的鐵炮百合(Lilium longiflorum Thunb.)，取幼嫩百合花苞(長度2公分以內)，在無菌操作箱內，先浸入95%酒精內，隨即取出在酒精燈上以火點燃，迅速過火作表面消毒。之後剝開外層苞片，取內層的花瓣、和雄蕊花絲，連同小花梗、花苞基部等進行培養。小花梗和花絲整個作為培植體，而花苞基部和花瓣則橫切成約0.5公分長作為培植體。
培養基組成份參考Chang et al. (2000)報告，為全量MS加2,4-D 3.0 mg/l、BA 0.25 mg/l、蔗糖30g/l、洋菜8.0 g/l，pH值5.8。培養基放置於小型廣口瓶中，每一瓶約25 ml。每一個廣口瓶中培養6個培植體(花絲或花瓣)，試驗重複7次，每次取4朵花至14朵花不等，總共採取73朵花進行本試驗。培養6週之後調查培植體產生癒傷組織之比率。
另為探討不同濃度之2,4-D與BA組合，對於誘導百合產生癒傷組織之難易，取鐵炮百合花絲為培植體進行培養。培養基成份以MS為基本，添加2,4-D (0, 1.0, 3.0 mg/l)與BA (0, 0.25 mg/l)相組合，其餘成份：蔗糖30g/l、洋菜8.0 g/l，pH值5.8。試驗於小型廣口瓶中進行，每瓶中放置6個花絲，每種處理各重複10次，培養6週之後調查培植體產生癒傷組織之比率。
二、百合基因轉殖之研究
(一)抗生素hygromycin對百合組織培養之影響
由於本試驗所採用之質體(pCAMBIA1301)內帶有抗hygromycin基因，可作為篩選指標，而植物對於hygromycin有忍耐性，為瞭解百合花絲和癒傷組織對於hygromycin之忍耐極限（致死濃度），首先進行各種濃度測試，以LD3為基本培養基配方，再添加hygromycin濃度為：0 (對照組)、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/l等，共7種處理。試驗於直徑9公分之培養皿中進行，每一培養皿倒入大約25 ml的培養基，其上放置6個（或6團）培植體，每一處理各4重複。之後每週調查癒傷組織褐化情形，並估算褐化百分比，試驗於7週後結束。
(二)農桿菌轉殖法
利用鐵炮百合花絲進行基因轉殖試驗，所使用之農桿菌系為LBA4404，內含一個雙偶型質體pCAMBIA1301，具有抗抗生素(hygromycin)基因，再構築一段GUS基因和trypsin inhibitor基因等，均以CaMV 35S啟動子啟動，基因構築為台灣大學葉開溫教授所提供。以hygromycin為選拔用藥劑，並以GUS組織化學染色之藍色表現為標記。
供測試之培植體為台灣原生鐵炮百合之花絲，由幼嫩花苞取下備用。農桿菌先以LB培養基在37℃之下培養一夜之後，再以液體LD3培養基加以稀釋(1:1)。隨即將花絲放入農桿菌液中使其自然感染，再撈起以濾紙吸乾，之後放置於半固體LD3培養基上，在30℃之環境下進行共培養。共培養之培養基有二種，一添加acetosyringone (AS)，一則否，兩者進行比較，以測試AS對轉殖效率之影響。每一個花絲視為一單位，培養7週之後調查花絲產生癒傷組織之比率，以及白化比率。
為瞭解農桿菌液浸漬時間長短、及共培養時間長短對轉殖之影響，分別進行二項試驗探討：一、花絲浸漬農桿菌時間為：10、20、30分鐘等3種處理；二、共培養時間為：1、2、3天等3種處理。轉殖處理後取出少量樣品，浸漬於x-gluc溶液中（參考McCabe et al. 1988所用之方法），置於37℃恒溫箱中24小時，進行組織化學染色，以檢測GUS基因表現情形。
(三)基因槍轉殖法
轉殖試驗所用之質體，與前一農桿菌轉殖試驗相同，惟質體先行轉入大腸桿菌體內。含質體之大腸桿菌先行以LB培養基大量繁殖，經過培養一夜後，再依循Lin et al. (2000)所敘述之方法，抽取純化之質體DNA，再將其包覆於1.0μm之金粒子上備用。
所使用的基因槍為PDS-1000/He粒子傳送系統(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)，以高壓氦氣為動力，在真空狀態下，藉高速推力穿透細胞壁，將金粒子以及包覆於其上的DNA分子送進植物細胞內。機械裝置設定為：真空狀態25 inch Hg、推力1100 psi、射擊距離6 cm。每一份材料射擊一次，每次射擊使用的金粒子量為0.5 mg，DNA量約為4μg。
供測試之培植體為鐵炮百合癒傷組織細胞系LG41，外觀呈淡黃色，粉末狀。每一團癒傷織視為一培植體單位，其直徑約1.0公分。基因槍轉殖程序依循Lin et al. (2000)所報告之方式為之，試驗進行前將癒傷組織集中移到培養皿正中心處，直徑為2.5公分，基因槍射擊後次日再將癒傷組織移動，分散於培養皿上各處。一次試驗總共處理12個培養皿。
射擊3天後，取出少量癒傷組織細胞，浸漬於x-gluc溶液中（參考McCabe et al. 1988所述之方法），放入37℃恒溫箱中24小時，進行組織化學染色，以檢測GUS基因表現情形，之後每週重複檢測一次。射擊30天後再將培植體移至含hygromycin (40 mg/l)之選擇性培養基上培養，以便選拔抗性細胞系。