鐵炮百合癒傷組織再生系統應用於基因轉殖之研究初報－討論 - 農業知識入口網

討論
一、百合癒傷組織之誘導與再生系統之建立
在鐵炮百合方面，本試驗研發二個癒傷組織再生系統，一為透過胚珠培養，另一為透過花絲培養而來，癒傷組織繼代培養後以產生小鱗莖的方式，培養成完整植株。由於幼嫩胚珠具有很強的再生能力，因此利用胚珠培養建立再生系統，在其他單子葉花卉植物也甚為常見，例如百合水仙（Hutchinson et al. 1994; Van Schaik et al. 1996）。此項系統之缺點是胚珠乃由有性生殖而來，後裔植株之遺傳性狀與原來的母株會有差異性存在，因此不適於作商業品種大量繁殖之用，而常應用於遠緣雜交育種研究，以克服種間雜交障礙（Van Tuyl et al. 1991），其優點為繁殖效率高，在短期間內可以大量獲得，且穩定供應試驗研究所需之癒傷組織材料，因此也常被從事基因轉殖研究所採用。
百合植株之器官，可用以誘導產生癒傷組織，建立再生系統後進行量產，例如花柱及花梗（Tribulato et al. 1997a）、花絲（Arzate-Fernandez et al. 1997）、鱗片（Van Harmelen et al. 1997）等，本研究利用鐵炮百合花絲為培植體，誘導產生塊狀癒傷組織，亦可繼代培養，建立一再生繁殖系統。花絲培養後產生癒傷組織的成功率高，且反應迅速，培養一週之後即可見到反應，為良好的試驗材料，可應用於基因轉殖試驗。
前人研究報告指出鐵炮百合Snow Queen品種的花柱以及花梗切片培養，會產生二種癒傷組織，一種是塊狀(compact)，容易分化為植物器官；另一種是粉末狀(friable)，分化程度較低，可加以利用作懸浮培養，產生擬胚(Tribulato et al. 1997a)，本研究結果與其結果相類似，花絲培養後產生塊狀癒傷組織，胚株培養則產生粉末狀癒傷組織。
癒傷組織再生系統可否應用於百合種苗大量繁殖，迄無定論，主要必須考慮植株是否有變異現象存在。Priyadarshi and Sen (1992)培養鐵炮百合鱗片癒傷組織，將其置於培養基上三年，其快速再生之能力不減，且檢查其染色體，並無變異現象發生。Arzate-Fernandez et al. (1997) 培養鐵炮百合花絲癒傷組織，之後所獲得的植株，經外觀目視，或經同功異構酵素法測定，或染色體檢測，均無變異現象，因此認為是一穩定可行之繁殖法。然而Van Harmelen et al. (1997) 培養鐵炮百合鱗片癒傷組織，此一癒傷組織置於20℃黑暗中保存三年仍具有再生能力，400個再生植株中有14株外表具有變異性狀，例如葉色葉形變異、雄不稔、矮化等。本試驗培養鐵炮百合胚珠或花絲癒傷組織，所獲得之植株，其外觀並未發現有變異現象，應可利用於繁殖種苗。
二、百合基因轉殖
單子葉植物細胞對於基因轉殖之選拔用抗生素，如kanamycin，具有相當大的耐抗性，在鬱金香方面，濃度高達500 mg/l時，植株還能存活（Wilmink and Dons 1993），因此在基因轉殖上，必須慎選抗性基因並配合適當篩選藥劑，才能提高轉殖效率。在眾多抗生素中，hygromycin被認為是一種選拔效率較好的藥劑，應用在單子葉植物水稻基因轉殖方面極為成功，濃度50 mg/l即可達到篩選之目的（Rashid et al. 1996）。本試驗中鐵炮百合花絲培植體，以及癒傷組織培植體對於hygromycin 的最低忍受極限，經測試結果均為40 mg/l，此一濃度適合作為鐵炮百合基因轉殖試驗之篩選劑量。
基因之啟動子，為影響植物基因轉殖成功率的重要因素之一，Tribulato et al. (1977a)研究結果顯示，基因轉殖試驗常用的啟動子如CaMV 35S、水稻actin、玉米ubiquitin等，應用於百合癒傷組織基因轉殖試驗，轉入百合細胞的基因均有表達現象。本研究所使用之GUS基因是由CaMV 35S啟動子所控制，轉入至鐵炮百合癒傷組織細胞之後，同樣有暫時性表達現象，與其結果相類似。轉殖處理後之培植體在含有hygromycin的培養基上存活時間超過50天，惟其後並無進一步再生的現象，是否抗hygromycin基因未表達，或有其他原因，須進一步試驗探討。