鐵炮百合癒傷組織再生系統應用於基因轉殖之研究初報－結果 - 農業知識入口網

結果
一、胚珠培養產生癒傷組織
培養360個鐵炮百合幼嫩胚珠，誘導產生癒傷組織約30團，每一團癒組織生長活力各異，每個月繼代培養一次，以防止褐化。經過218天後，選拔出一個生長活力旺盛的癒傷組織細胞系，編號「LG41」，其外觀呈粉末狀(friable)或小顆粒狀(granular)，顏色為淡黃色(圖1)。經繼代培養後，癒傷組織表面上可不斷產生新的癒傷組織，形成一循環再生系統。將此種癒傷組織移到不含生長調節劑的MS培養基上培養，則在其表面上產生小鱗莖(圖2)，經繼代培養之後發育為完整植株(圖3)，植株移植到田間種植後，於第二年春季開花，以肉眼觀察其外觀性狀，各植株之間無明顯差異存在(圖4)。
二、花部組織誘導產生癒傷組織
鐵炮百合花朵之小花梗及花苞基部培養後，大多數的培植體均出現黴菌污染現象，因此無法獲得完整的試驗數據，僅花絲和花瓣部份未有發黴情形，試驗結果列如表一所示。花絲培養之後，其基部原連接花瓣之處開始膨大，之後逐漸形成癒傷組織，其外觀呈塊狀(compact)，結構較為緊密。花瓣培養之後亦會產生塊狀癒傷組織，但時間較為延後，其產生的部位主要在花瓣生理極性的基部之切口處。花絲產生癒傷組織比率為91.8%，花瓣為31.0%。
進一步比較不同生長調節劑組合對花絲培養產生癒傷組織之影響，鐵炮百合花絲放置於培養基上，培養7天之後，其基部出現膨大現象，部份花絲的切口處開始產生白色不規則狀的癒傷組織，培養時間越久癒傷組織發育的情形越為明顯，然而部份花絲僅膨大並未產生癒傷組織，甚至逐漸褐化。培養6週後之調查結果如表二所示。培養於不同組成份的培養基，花絲變化的情形頗為不同，在完全不含植物生長調節劑的MS基本培養基、或僅含BA的培養基上，花絲僅出現膨大現象，並不產生癒傷組織，而在含有2,4-D的LD1和LD3培養基上，花絲則會產生癒傷組織，且隨著2,4-D濃度的增加，其出現的比率有增加的趨勢。另一方面，花絲褐化的比率，則隨著2,4-D濃度的增加，而有降低的趨勢。
取花絲培植體所產生的癒傷組織，繼代培養於LD3培養基上，二個月後產生小鱗莖，之後萌發成完整小植株。
三、百合基因轉殖之研究
（一）抗生素hygromycin對百合組織培養之影響
鐵炮百合花絲培養於不含hygromycin的LD3培養基之後，有70.8%的培植體在花絲的基部產生癒傷組織，花絲本身則由白色轉變成黃綠色。花絲培養於含有hygromycin的培養基，對於癒傷組織的發生有抑制作用，低濃度時(1.25 mg/l)抑制效果不明顯，隨著濃度增加，抑制效果愈為明顯，當hygromycin濃度為20 mg/l時，所有培養的花絲均無產生癒傷組織；濃度提高至40 mg/l時，全部的花絲也均無產生癒傷組織，而且花絲呈白化死亡現象(表三)。
鐵炮百合癒傷組織(LG41)培養於不含hygromycin的LD3培養基之後，其生長情況極為良好，且未發生褐化現象。癒傷組織培養於含有hygromycin的培養基，對百合癒傷組織之發育有抑制效果，低濃度時(2.5 mg/l以下)效果不明顯，但隨著濃度增加，抑制效果愈為明顯；hygromycin濃度為10 mg/l時，100%的癒傷組織團塊均發生程度不一的褐化現象；濃度提高至40 mg/l時，全部的癒傷組織均褐化死亡(表四)。
（二）農桿菌轉殖法
鐵炮百合花絲經過農桿菌處理之後，置於含40 mg/l hygromycin之選擇性培養基上培養，培養3週之後，部份花絲變成白化，停止生長，部份花絲長出癒傷組織。試驗最後的結果顯示，花絲和農桿菌液浸漬的時間為30分鐘時，培植體產生癒傷組織的比率最高(表五)；而花絲與農桿菌共培養的時間為2日時，花絲褐化比率較低，且產生癒傷組織比率較高(表六)。部份花絲在含有hygromycin選擇性培養基上培養之後，產生癒傷組織，顏色由白轉成綠色，可存活一段時間，惟在培養51天之後所有的培植均褐化死亡。
（三）基因槍轉殖法
鐵炮百合癒傷組織LG41經基因槍射擊後次日，表面產生許多暗色流質，並且在其後逐漸轉呈褐色，對於癒傷組織細胞之成長有所阻礙。轉殖後第3天取癒傷組織以組織化學法檢測，結果部份細胞呈藍色反應，顯示GUS基因已有暫時性表達現象（圖7）。之後每週固定進行檢測，連續進行三次，每次均測得藍色反應，而且藍色程度愈來愈深，顯示GUS基因表達頗為穩定。63天之後，有少部份癒傷組織在含有hygromycin之培養基上仍能存活，其外觀為深黃色顆粒狀（圖8），惟經繼代培養最後仍全部褐化死亡，未有進一步分化再生的現象。