宜花地區水稻徒長病發病情形、病原檢測與其對藥劑之感受性--材料與方法-5 - 農業知識入口網

三、供試菌株蒐集、分離及鑑定
（一）供試菌株蒐集與分離
於育苗場及田間採集徒長病株，將病株外表清洗，切取莖基部的維管束片段，浸泡於0.5%漂白水30 s，放入無菌水漂洗30 s，以濾紙吸乾多餘水分，放置在WA（water agar, agar 10g, water 1L, 日本試藥）平板培養基上。置於28℃培養箱，12 hr光照，隔天切取菌絲尖端置於馬鈴薯葡萄糖瓊酯培養基（potato dextrose agar 簡稱PDA, potato dextrose powder 39g, water 1L, Difco），放置3-5 d待產孢，挑取單一孢子純化並且加以保存，保存方式為將單孢培養於1/2 PDA上，於25℃、12 hr/12 hr光照週期下培養7 d過後，切取菌絲尖段至砂管中保存。
（二）菌株鑑定
供試菌株鑑定主要是以型態觀察，並且輔以分子生物學鑑定；將放置3-5 d產孢的培養基置於解剖顯微鏡下，並於400倍光學顯鏡下觀察產孢情形及孢子形態。另移植至Potato Dextrose Agar（PDA）以觀察其巨觀之菌落形態。
萃取徒長病菌之DNA（許2013）後，利用David等人針對Fusarium spp.之translation elongation factor（TEF 1-α）基因序列所發表之引子對ef-1/ef-2（Amatulli et al., 2010）[ef-1 （5´-ATGGGTAAGGA（A/G）GACAAGAC-3´）/ef-2 （5-GGA（G/A）GTACCAGT（G/C）ATCATGTT-3´）]，所添加之引子濃度約10 μM，分別加入PCR各反應物，總反應體積20 μl，進行PCR反應。增幅TEF-1α區域序列之條件為：先以95℃反應5 min，之後進行94℃45 s，52℃45 s，72℃2 min，共30個循環，最後進行72℃7 min 1個循環。增幅後之產物則以1.5% agarose進行電泳分析。另將PCR產物委託源資生物科技公司進行解序後利用NCBI（National Center for BiotechnologyInformation）之BLAST （Basic Local Alignment Search Tool）資料庫進行菌株之序列分析比對。