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台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 71(2):123–134 (2022) 研究報告
DOI:10.6156/JTAR.202206_71(2).0003
水稻花粉活力檢測方法研究
夏奇鈮1　游舜期2　曹進義3　蘇永傑4　李長沛5,*
摘要
夏奇鈮、游舜期、曹進義、蘇永傑、李長沛。2022。水稻花粉活力檢測方法研究。台灣農
業研究71(2):123–134。
水稻是台灣最重要的糧食作物，其產量與米質會受高溫的影響而下降，在水稻的生長過程中以開花當日
對高溫最為敏感，因此瞭解花粉的耐熱性是評估耐熱水稻品種的重要指標。本研究除最適化水稻花粉培養
所需配方外，並比較花粉染色法、花粉培養與電阻抗式流式細胞儀 (impedance flow cytometry; IFC) 3種花粉
活力檢測方法，同時以IFC檢測經不同溫度處理後花粉的活力變化。試驗以稉稻 「台南11號」 (‘Tainan 11’;
‘TN11’) 與耐熱秈型陸稻 (aus type) ‘Nagina 22’ (‘N22’) 為材料，針對花粉培養液中之蔗糖、硼酸及硝酸鈣逐
項進行最適濃度測試，結果顯示2品種之花粉皆以含有22.5%蔗糖、60 mg L-1硼酸與200 mg L-1硝酸鈣之培
養液可獲得最高之花粉萌發率。比較3種染劑分別為二乙酸螢光素酯 (fluorescein diacetate; FDA)、2,3,5-氯化
三苯基四氮唑 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride; TTC) 以及碘化鉀 (I/KI) 對水稻花粉之染色率，結果顯示2
2
品種皆以1% I/KI之染色率最高，TTC之染色率最低，FDA染色率居中。利用花粉培養、FDA染色及IFC
2
分析三種方法進行花粉活力檢測，在 ‘TN11’ 和 ‘N22’ 均顯示IFC檢測與花粉培養或FDA染色之結果無顯著
差異，顯示IFC可作為花粉活力快速檢測方法。進一步利用IFC檢測花粉經25–45℃溫度處理15 min後之活
力變化，結果顯示 ‘TN11’ 之花粉活力隨著溫度上升明顯下降；而 ‘N22’ 在溫度上升至35℃時才開始下降，
顯示 ‘N22’ 花粉對於高溫的耐受性較 ‘TN11’ 為高。
關鍵詞：水稻、花粉發芽培養基、花粉活力、電阻抗式流式細胞儀。
前言 技術幫助作物度過逆境挑戰外，長期來看，選
育耐高溫逆境的水稻新品種更為根本，因此如
近百年來，人類以石化燃料為主的能源活
何對現有水稻遺傳資源的耐熱性作出快速有效
動型態，加速了地球溫室氣體量的累積，進而
率的評估，是育成耐熱水稻新品種的第一步，
導致全球氣溫持續上升以及極端天氣的頻繁
為此我們有必要瞭解高溫如何影響水稻的生長
發生，對農業生產系統產生直接之衝擊 (Inter- 發育。
governmental Panel on Climate Change 2013)。 水稻在不同發育時期遭遇高溫所受到的影
水稻是僅次於小麥的全球最重要穀類作物，也 響並不相同，營養生長期的高溫，直接造成
是台灣最主要的糧食作物，台灣水稻的生產亦 葉片光合作用率下降、同化產物減少、發生
必須面對全球氣候暖化衝擊的挑戰 (Ho et al. 過氧化傷害，導致植株的生長受抑制，如分
2013)。對抗氣候暖化，除了研發各種栽培調適 蘖減少、株高增長緩慢等。生殖期遭遇高溫，
投稿日期：2021 年8月13日；接受日期：2021 年11月30日。
* 通訊作者：charngpei@tari.gov.tw
1 農委會農業試驗所生物技術組研究員。台灣 台中市。
2 農委會農業試驗所生物技術組助理研究員。台灣 台中市。
3 農委會農業試驗所生物技術組聘用助理研究員。台灣 台中市。
4 農委會農業試驗所生物技術組計畫助理。台灣 台中市。
5 農委會農業試驗所作物組副研究員。台灣 台中市。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 112233 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4455124 台灣農業研究　第71卷　第2期
則以抽穗開花期影響最大，其次是孕穗期 (花 硝酸鈣濃度進行最適化研究，建立適用於水稻
粉母細胞減數分裂期)，而抽穗期又以開花當 花粉萌發之培養基作為花粉活力評估之用外，
日受高溫影響最大，高溫能讓花粉粒的膨脹率 並比較3種花粉活力染劑，分別為二乙酸螢光
降低，導致花藥囊開裂比例下降，進而影響花 素酯 (Fluorescein diacetate; FDA)、2,3,5-氯化
粉粒的散出，造成雌蕊柱頭上花粉數不足，高 三苯基四氮唑 (2,3,5-triphenytetrazolium chlo-
溫同時也讓花粉管的伸長受阻，最終表現於 ride; TTC) 與碘化鉀 (I /KI) 對水稻花粉之染色
2
穎花稔實率與米質的降低 (Matsui et al. 2000, 率。此外，比較IFC分析、花粉培養及FDA染
2001)。值得一提的是，上述生殖過程在穎花 色3種花粉活力檢測方法，用以瞭解IFC檢測
開放後約1 h間即可完成，所以發生於開花前 技術與現行花粉活力檢測方法獲得之結果是否
1 h或開花後1 h的高溫對穎花授粉的影響力 具有差異性；並以IFC檢測花粉經不同溫度處
將明顯降低，也就是說高溫效應對水稻生殖影 理後其活力的變化，研究結果將應用於未來耐
響巨大，但其最關鍵的影響在空間上僅局限於 熱水稻品種篩選之用。
一個器官 (穎花)，在時間上則極為短暫 (1 h)，
因此要瞭解高溫對生殖生長的危害必須有精確 材料與方法
的評估方式 (Fahad et al. 2018)。傳統耐高溫
水稻材料與栽培管理
品種的篩選多在田間或設施下進行，但要讓
供試之水稻種子由農試所作物組水稻研究
開花中的穎花感受到高溫，並針對受影響之
室提供，分別為耐熱秈型陸稻 ‘N22’ 與稉稻
穎花完成調查，在實務上有其困難度 (Julia &
‘TN11’。將發芽2 wk後之小苗移至裝有田土
Dingkuhn 2013)。這也說明若能找到反應受測
之塑膠盆 (61.7 × 42.8 × 8.9 cm3) 內種植，每
品種對高溫耐受性的衡量指標，例如花粉的耐
盆種4–6株，並於分蘖與幼穗形成期施用台肥
熱特性，將有助提高耐熱水稻品種篩選的精確
農友牌硝磷基特43號肥料 (N-P O -K O = 15-
度與效率 (Coast et al. 2016)。 2 4 2
15-15) 共 25 g，植株於農試所生技組裝有風
傳統上對花粉活力的評估有許多方法，依其
扇水牆溫室內栽培，每週灌水3次。
實施處可分為in vivo (體內) 與in vitro (體外)，
in vivo直接於植物組織上觀察，如觀察柱頭上 花粉取樣與染劑配製
花粉數、花粉管伸長情形等，一般需要透過組
選取剛突出劍葉葉枕之稻穗加以標記，於
織固定、染色或切片等技術的配合，精確度高
第2天將標記稻穗之分蘖從植株基部剪下並插
但觀察之數量有限，因此較適合作為現象觀察
入水杯中帶回，每一品種選取3–5株，每株取
而非大量篩選之用 (Shi et al. 2018)。In vitro 1分蘖，將分蘖置於無菌操作台之日光燈下促
以細胞染色法或花粉發芽培養最為常用 (Song 進穎花開放。取每一穗之主枝梗上段即將開裂
et al. 2001)，近年來則有針對單一細胞對電流 之穎花，以鑷子將花藥自穎花中取出，放入微
之阻抗反應加以分析的電阻抗式流式細胞儀 量試管中加以輕壓釋出花粉，作為不同染劑染
(impedance flow cytometry; IFC)，IFC每一樣 色或花粉培養試驗之用。
品分析之細胞數可從數千至數萬不等，需要的 將2 g碘化鉀完全溶解水中後，再加入 1
時間僅數十秒至數分鐘，與上述必須透過顯微 g 碘並定量至100 mL配製1% I /KI，並以深
2
鏡觀查染色之花粉粒數或計算花粉管萌發比率 色瓶保存備用。以丙酮為溶劑配製0.2% FDA
的傳統方法，具有節省人力與時間並提高檢測 (A 液) 保存於深色瓶內，另行配製30% 蔗糖
效率之優勢 (Heidmann et al. 2016)。 溶液，以 A 液緩慢加入蔗糖溶液中並攪拌均
本研究以台灣栽培面積最多的稉稻「台南 勻，至液體呈現白色混濁後停止是為B液，取
11 號」(‘Tainan 11’; ‘TN11’) 與來自印度的耐 B 液作為染色之用 (Tseng et al. 2013)。以磷
熱秈型陸稻 ‘Nagina 22’ (‘N22’) 為材料，除 酸緩衝液配製1% TTC染液，並保存於深色瓶
針對花粉培養液中最重要的成分蔗糖、硼酸及 內備用。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 112244 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4466水稻花粉活力檢測方法研究 125
水稻花粉發芽培養液中 3種成分之濃度 為將花粉放入裝有1% TTC染液的離心管中，
最適化 置於30℃黑暗環境下培養3 h後，吸取50 μL
花粉染色液滴於凹槽玻片後進行鏡檢。每一染
蔗糖濃度測試：稻穗之取得同花粉取樣所
色處理共進行3重複，每一重複共調查100粒
述，每一穗取5朵穎花，將穎花中之6個花藥
花粉。
囊取出5個，分別置入裝有5種蔗糖濃度處理
之500 μL培養液中，將分別取自5朵穎花之 以花粉培養、FDA染色與IFC分析進行
5個花藥粒混合擠壓釋出花粉，作為1重複， 花粉活力檢測
共3重複。培養液中皆含有60 mg L-1 硼酸，
花粉取樣與上述染色法相同，花粉培養試
並分別添加蔗糖使其濃度為 20、22.5、25、
驗之操作為先於凹槽玻片上滴50 μL花粉培養
27.5 及 30% 共 5 種處理。將 5 個處理之花粉
液 (22.5% 蔗糖、60 mg L-1硼酸、200 mg L-1
培養液置入30℃恆溫箱中黑暗培養10 min後，
硝酸鈣)，再加入花粉並蓋上蓋玻片，置入裝
取50 μL花粉培養液滴於凹槽玻片上進行顯微
有濕潤濾紙之保鮮盒內，於 30℃黑暗環境下
鏡檢測，每一重複共觀察100粒花粉，將花粉
培養10 min後進行顯微鏡檢測。花粉培養與
管長度超過花粉粒直徑者視為發芽，計算花粉
FDA 染色處理，共進行 3 重複，每 1 重複調
發芽比率。
查 100 粒花粉。IFC 分析方法使用之電阻抗
硼酸濃度測試：稻穗取得同上花粉取樣所
式流式細胞儀型號為 Ampha Z30 (Amphasys,
述，每一花穗取5朵穎花，將穎花中之6個花
Root, Switzerland)，將花粉材料放入裝有 500
藥粒取出，分別置入裝有6種硼酸濃度處理之
500 μL 花粉培養液中，將分別取自 5 朵穎花 μL AF6 buffer (Amphasys, Root, Switzerland)
之5個花藥粒混合擠壓釋出花粉，作為1重複， 的離心管中，使用100 µm濾網進行過濾，將
共3重複。培養液含有22.5% 蔗糖並分別添加 濾液以AF6 buffer定量到500 µL混合均勻後
適量之硼酸，使其濃度為25、50、60、100、 上機檢測，同樣進行3重複。
150及200 mg L-1共6種處理。培養條件以及 以IFC檢測溫度處理對花粉活力之影響
花粉發芽率計算方式同上蔗糖處理所述。
選取稻穗突出劍葉葉枕約 5 cm 之分蘖 6
硝酸鈣濃度測試：於含有 22.5% 蔗糖與
支，從基部剪下並插入水杯中帶回，置於無
60 mg L-1 硼酸之培養液中，分別添加適量之
菌操作台之日光燈下使穎花開放，取位於花
Ca(NO ) ．4H O，使其濃度分別為60、100、
3 2 2 穗上段主枝梗上即將開裂之穎花，每穗取 6
200、300及400 mg L-1共5種處理。花粉取樣、
朵潁花，將 2穗共12朵穎花之花藥取出混合
培養條件以及花粉發芽率計算方式同上蔗糖處
放入裝有 1.8 mL AF6 buffer 的微量試管中加
理所述。
以擠壓，以 100 µm 濾網過濾，將濾液分裝
以 FDA、TTC 及 I2/KI 染色法檢測花粉 至 6 個微量試管並定量至 500 μL，將裝有花
活力 粉濾液之微量試管置於不同溫度設定之乾浴
稻穗取得方式同花粉取樣所述，取每穗主 器中，溫度設定分別為 25、30、35、40、45
枝梗上段即將開裂之穎花1朵，以鑷子將花藥 及 100℃，經 15 min 處理後進行分析，每一
取出，將分別取自5朵穎花之花藥粒一起放入 溫度處理共 3 重複。IFC 分析使用 120 μm 孔
微量試管中輕壓釋出花粉，以混合後之花粉作 徑晶片，電波頻率設定為12 MHz、馬達轉速
為3種染劑試驗之材料，此為1重複。於凹槽 35 rpm，其他檢測參數 Modulation/Amplifica-
玻片上滴 50 μL 之 1% I /KI 染色液，加入適 tion/Demodulation設定為4/6/2，trigger level:
2
量花粉後蓋上蓋玻片，置於30℃黑暗環境下培 0.1，設定分析數量為 30,000個細胞，並透過
養10 min後進行鏡檢；FDA染色之培養條件 AmphaSoft 2.0 (Amphasys, Root, Switzerland)
相同，但染色時間為 15 min；TTC 染色過程 軟體進行結果分析。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 112255 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4466126 台灣農業研究　第71卷　第2期
統計分析方法 表1.　花粉培養液中蔗糖濃度對水稻花粉萌發之影
響。
試驗採用完全逢機設計 (completely ran-
Table 1.　Effect of sucrose concentration on rice pollen
domized design; CRD)，試驗所得資料經 SAS germinationz.
Enterprise Guide 7.1 (SAS Institute Inc., Cary, Germination (%)
NC, USA) 套裝統計分析軟體進行變方分析 Sucrose (%) ‘Nagina 22’ ‘Tainan 11’
(analysis of variance; ANOVA)。若處理間差異 20.0 31.0 ± 2.1 by 19.3 ± 0.6 b
顯著 (P < 0.05)，則利用最小顯著差異性測驗 22.5 39.7 ± 1.2 a 34.3 ± 1.3 a
(least significant difference test; LSD) 比較各 25.0 22.3 ± 1.9 c 18.3 ± 1.5 b
處理平均值間之差異。 27.5 19.7 ± 1.2 c 13.3 ± 1.5 c
30.0 7.7 ± 0.9 d 11.0 ± 1.2 c
結果 z Pollen germination medium contained various concentration
of sucrose and 60 mg L-1 boric acid.
水稻花粉發芽培養液中 3種主成分濃度 y Means with different letters in the same column are signifi -
cantly different (P < 0.05) by least significant difference
最適化測試 (LSD) test.
本試驗針對花粉培養液中最重要的3種成
分—蔗糖、硼酸及硝酸鈣依序逐項測試其最 表2.　花粉培養液中硼酸濃度對水稻花粉萌發之影
佳濃度。首先將培養液中硼酸濃度固定於預 響。
備試驗中之最佳濃度60 mg L-1，以2.5%蔗糖 Table 2.　Effect of boric acid concentration on rice
pollen germinationz.
為一個濃度分級，測試20–30% 蔗糖濃度對2
(品) 種水稻花粉萌發之影響，結果如表1與圖 Germination (%)
1所示。‘N22’ 與 ‘TN11’ 兩 (品) 種皆以含有 H3BO3 (mg L-1) ‘Nagina 22’ ‘Tainan 11’
22.5%蔗糖之培養液獲得最高花粉萌發率，分 25 8.0 ± 1.2 dy 11.7 ± 1.2 d
50 19.0 ± 1.7 b 24.0 ± 1.7 b
別為39.7%與34.3%，且與其他濃度間呈現顯
60 26.0 ± 1.7 a 32.3 ± 1.9 a
著之差異。
100 12.7 ± 0.3 c 18.7 ± 2.0 c
將培養液之蔗糖濃度固定於22.5%，測試
150 10.3 ± 0.9 cd 13.3 ± 2.3 d
25–200 mg L-1硼酸濃度對2 (品) 種水稻花粉
200 7.0 ± 1.7 d 13.7 ± 0.3 cd
萌發之影響，結果如表2所示。‘N22’ 與 ‘TN11’
z Pollen germination medium contained various concentration
兩 (品) 種皆於含有60 mg L-1硼酸之培養液獲 of boric acid and 22.2% sucrose.
得最高之花粉萌發率，分別為26.0%與32.3%， y Means with different letters in the same column are signifi -
cantly different (P < 0.05) by least significant difference
顯著高於其他濃度處理。 (LSD) test.
(A) (B)
圖1.　水稻花粉於修正後之花粉培養液中萌發之情形。水稻品種 (A) ‘Nagina 22’；(B)「台南11號」。
Fig. 1.　In vitro pollen germination of two rice cultivars in the modifi ed medium. Rice cultivar of (A) ‘Nagina 22’
and (B) ‘Tainan 11’. Bar = 100 µm.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 112266 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4477水稻花粉活力檢測方法研究 127
將培養液中蔗糖與硼酸濃度分別固定為 表4.　以3種細胞染色方法檢測水稻之花粉染色率。
22.5%與60 mg L-1，測試60–400 mg L-1 硝酸 Table 4.　Comparison of various cell staining methods
on rice pollens.
鈣對水稻花粉萌發之影響，結果如表3所示。
‘N22’ 與 ‘TN11’ 兩 (品) 種皆以含有200 mg L-1 Staining ratio (%)
Staining Methodz ‘Nagina 22’ ‘Tainan 11’
硝酸鈣之培養液具有最高花粉萌發率，分別為
I/KI 89.7 ± 1.5 ay 93.7 ± 2.9 a
76.0%與78.7%，顯著高於其他濃度處理。 2
FDA 78.0 ± 2.0 b 80.7 ± 1.5 b
綜合上述三試驗之結果，2 (品) 種水稻對3
TTC 40.3 ± 2.3 c 55.3 ± 2.5 c
種成分及其最適濃度之反應具有一致性，花粉
z FDA: fluorescein diacetate; TTC: 2,3,5-triphenyltetrazolium
萌發率會隨3種成分濃度上升至最適濃度後下
chloride.
降，花粉培養液中之蔗糖、硼酸及硝酸鈣之最 y Means with different letters in the same column are signifi-
cantly different (P < 0.05) by least significant difference
適濃度依序為22.5%、60 mg L-1與200 mg L-1， (LSD) test.
於此培養液中2 (品) 種之花粉管萌發率皆可達
75%以上 (表3)。 以及將花粉置入緩衝液後以 IFC 進行花粉活
以FDA、TTC及I /KI染色法檢測花粉活力 力分析，結果如表5所示。‘N22’ 花粉以FDA
2 之染色率最高為 73.3%，與 IFC 分析結果差
水稻花粉分別以I /KI、FDA與TTC染色
2 異不顯著，但卻顯著高於花粉培養之結果。
法檢測活力，花粉於染色處理完成後以光學或
‘TN11’ 則顯示 3 種檢測方法差異皆不顯著，
螢光顯微鏡觀察花粉粒染色之情形。結果顯示
在 65.7–73.6% 之間。除利用 ANOVA 以 LSD
‘N22’ 與 ‘TN11’ 兩 (品) 種之花粉染色率皆以
比較各處理平均值間之差異外 (表5)，並以成
I /KI 最高，分別為 89.7% 與 93.7%，其次為
2 對t檢定進行兩兩處理組平均值差異性檢定，
FDA，而以 TTC最低，3種染色法呈現顯著差
結果顯示在測試的 2 (品) 種中 IFC 與花粉培
異 (表4、圖2)。
養或IFC與FDA染色法均顯示無明顯差異 (資
以花粉培養、FDA染色與IFC分析進行 料未顯示)。
花粉活力檢測 以IFC檢測溫度對花粉活力之影響
比較於 30℃黑暗環境下，以 FDA 染劑 首先將經100℃處理後之花粉以IFC分析，
進行 15 min 染色或於花粉培養液中培養 10 將呈現之細胞族群定義為死亡細胞 (dead)，並
min，再以顯微鏡計算染色率與花粉萌發率， 於此細胞群右方劃一十字線，以相對100℃處
理死亡細胞群十字線右上方之細胞群定義為具
表3.　花粉培養液中硝酸鈣濃度對水稻花粉萌發之 有活力之花粉 (viable)，右下方則為尚未死亡
影響。 但活力低下之細胞群 (non-viable) (圖 3)。將
Table 3.　Effect of calcium nitrate concentration on 經不同溫度處理後之花粉以 IFC 進行分析，
rice pollen germinationz.
記錄各溫度處理之活力細胞群、低活力細胞
Germination (%)
Ca(NO)．4HO 群、死細胞群占全體細胞之比例，結果如表
32 2
(mg L-1) ‘Nagina 22’ ‘Tainan 11’
6與表7所示。‘N22’ 之花粉經不同溫度處理
60 68.3 ± 2.2 by 62.3 ± 2.2 c
後，以25–30℃具有最高之花粉活力，比率在
100 64.0 ± 2.3 b 70.0 ± 1.7 b
59.9–62.3% 之間，其次為 35–40℃間，花粉
200 76.0 ± 2.1 a 78.7 ± 0.9 a
活力在53.5–54.1%之間時，溫度上升至45℃
300 37.3 ± 3.1 c 48.3 ± 3.2 d
時，具活力花粉之占比降至 46.5%。‘TN11’
400 34.0 ± 1.2 c 40.7 ± 0.9 e
花粉亦以25℃處理之花粉活力最高為61.3%，
z Pollen germination medium contained 22.2% sucrose, 60 mg L-1
溫度處理在25–40℃之間時，每上升5℃，花粉
boric acid and various concentration of calcium nitrate.
y Means with different letters in the same column are signifi- 活力隨溫度上升而明顯下降，具活力之花粉由
cantly different (P < 0.05) by least significant difference
(LSD) test. 61.3%下降至36.3%。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 112277 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4477128 台灣農業研究　第71卷　第2期
(A) (B)
(C) (D)
圖2.　「台南11號」水稻花粉以3種染劑染色後花粉呈色情形。染劑為 (A) I/K；(B) TTC；(C) FDA於螢光
2
暗視野下；(D) FDA於螢光明視野下觀察之情形。
Fig. 2.　Pollens of ‘Tainan 11’ staining with (A) I/KI; (B) 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC); (C) fl uorescein
2
diacetate (FDA) under fl orescence light with dark sight; and (D) FDA under fl orescence light with bright sight. Bar =
100 µm.
表5.　以不同方法檢測水稻花粉之活力表現。 植物所發表之花粉發芽培養基相關論文進行
Table 5.　Comparison of different methods on rice pol- 統計，針對配方中110個成分加以分析，結果
len viability analysis.
顯示最常用之成分及其占比分別為蔗糖 (89%)、
Germination rate & staining ratio (%) 硼酸 (77%)、Ca2+ (59%)、Mg2+ (44%)，以及
Methodz ‘Nagina 22’ ‘Tainan 11’ K+ (39%)。本研究亦以花粉培養基中最重要占
Germination 62.7 ± 2.1 by 65.7 ± 6.4 a
比之3成分蔗糖、硼酸及硝酸鈣進行最佳濃度
FDA staining 73.3 ± 4.2 a 71.7 ± 2.3 a
試驗。Kariya (1989) 比較 10、20 與 30% 蔗
IFC viability 69.2 ± 3.4 ab 73.6 ± 1.9 a
糖，以及比較 5–500 mg L-1 硼酸濃度對水稻
z FDA: fl uorescein diacetate; IFC: impedance fl ow cytometry.
y Means with different letters in the same column are signifi - 花粉培養之影響，指出水稻花粉發芽最佳之配
cantly different (P < 0.05) by least significant difference 方為 20% 蔗糖、20 mg L-1 硼酸與 1% 洋菜，
(LSD) test.
萌發芽率可達 87.3–91.6%，但蔗糖濃度提高
至 30% 時，萌發芽率降至 54–59%。Coast et
討論
al. (2016) 使用 20% 蔗糖、40 mg L-1 硼酸、
分析花粉活力的方法眾多，其中利用in 40–60 mg L-1硝酸鈣、3 mg L-1 Vitamin B1及
10% polyethylene glycol (PEG) 作為培養基，
vitro花粉培養因可直接獲得花粉萌發與花粉
花粉萌發率亦可達 80% 以上。上述兩研究顯
管伸長之數據，被認為是可信度較高的方法，
示水稻花粉培養所需成分相當簡單，本研究
但因不同種植物間花粉發芽所需之環境條件
除希望花粉培養基配方具有成分簡單之特性
並不相同，且花粉培養基所需成分在不同物
外，並希望其為純粹之液體培養基，其優點為
種或同物種不同品種間亦不盡相同，必須針
不需加熱溶解洋菜或 PEG，亦不需等待培養
對不同植物種類加以開發 (Shivanna & Ran- 基降溫方能使用，具有配製容易且可冷凍保
gaswamy 1992)。Tushabe & Rosbakh (2021) 存之優點；雖然成分簡單之液體培養基可能
根據 1,572 篇來自 114 科 412 屬總共 816 種 有滲透壓不理想之問題，並不適合花粉發芽
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 112288 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4488水稻花粉活力檢測方法研究 129
7.000 7.000
(A) (B)
5.843 5.833
4.687 4.667
z
H
M
0
0
2. 3.530 3.500
1
pl
m
A
2.373 2.333
1.217 1.167
0.060 0.000
190 210 230 250 270 190 210 230 250 270
Phase 12.00 MHz
圖3.　水稻 ‘Nagina 22’ 花粉經溫度處理後利用電阻抗式流式細胞儀以12 MHz交流電檢測之花粉細胞分布圖
形。花粉經 (A) 100℃ 處理15 min；(B) 25℃ 處理15 min。
Fig. 3.　Dot plots of rice ‘Nagina 22’ analyzed by impedance fl ow cytometry at 12 MHz. Pollens were treated with (A)
100℃ for 15 min and (B) 25℃ for 15 min.
表6.　水稻 ‘Nagina 22’ 花粉經不同溫度處理15 min後以電阻抗式流式細胞儀分析之花粉活力表現。
Table 6.　Pollen viability of ‘Nagina 22’ analyzed by impedance fl ow cytometry after various temperature treating
for 15 min.
‘Nagina 22’
Temperature (℃) Dead (%) Non-viable (%) Viable (%) Relative viable (%)z
25 33.2 ± 1.4 b 4.5 ± 0.7 b 62.3 ± 1.4 ay 100 ± 0.0 a
30 35.2 ± 2.1 b 4.8 ± 1.0 b 59.9 ± 1.8 a 96.2 ± 1.7 a
35 36.8 ± 3.2 b 9.1 ± 2.0 a 54.1 ± 1.3 b 86.8 ± 1.4 b
40 36.7 ± 2.2 b 9.9 ± 1.6 a 53.5 ± 0.9 b 85.9 ± 2.7 b
45 44.8 ± 1.6 a 8.7 ± 0.5 a 46.5 ± 1.7 c 74.8 ± 4.4 c
100 92.6 ± 1.5 6.4 ± 1.5 1.0 ± 0.1 1.7 ± 0.1
z Relative viable % = viable % at various temperature treatment/viable % at 25℃ × 100%.
y Means with different letters in the same column are signifi cantly different (P < 0.05) by least signifi cant difference (LSD) test.
需時較長之植物，但水稻花粉萌發相當快速 試驗不同之處，為本研究使用較小之蔗糖級距
(10–20 min) 則不受此限。本研究在預備試驗 (2.5%)，推測 Kariya 所使用之蔗糖濃度級距
時測試 12.5、15、17.5 及 20% 蔗糖濃度對水 太大 (10%) 不利得到正確之最適濃度。此外，
稻花粉萌發之影響，結果顯示以 20% 蔗糖處 Kariya (1989) 使用含有20%蔗糖、20 mg L-1
理得到最高之萌發率，與上述兩研究之結果相 硼酸與1%洋菜培養基即可獲得高於80%之萌
同，但因尚未見到濃度效應的下降，因此本研 芽率，但本研究中若使用僅添加蔗糖與硼酸之
究更進一步提高蔗糖濃度，測試花粉萌發率是 液體培養基，其最佳發芽率僅26.0–32.3% 之
否還能持續提高，結果顯示含有22.5 %蔗糖 間，推測Kariya配方中之洋菜應亦能提供有助
優於 20% 蔗糖以及其他濃度，本研究與上述 花粉萌發之營養元素。而本研究在含有22.5%
Kariya (1989) 在比較 10、20與30%蔗糖濃度 蔗糖、20 mg L-1 硼酸溶液中添加200 mg L-1硝
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 112299 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4499130 台灣農業研究　第71卷　第2期
表7.　水稻「台南11號」花粉經不同溫度處理15 min後以電阻抗式流式細胞儀分析之花粉活力表現。
Table 7.　Pollen viability of ‘Tainan 11’ analyzed by impedance flow cytometry after various temperature treating
for 15 min.
‘Tainan 11’
Temperature (℃) Dead (%) Non-viable (%) Viable (%) Relative viable (%)z
25 31.7 ± 1.5 dy 7.0 ± 1.9 b 61.3 ± 0.6 a 100 ± 0.0 a
30 35.6 ± 4.1 cd 10.1 ± 2.4 ab 54.4 ± 2.9 b 88.7 ± 4.2 b
35 39.3 ± 2.5 bc 13.3 ± 3.9 ab 47.4 ± 2.2 c 77.3 ± 3.5 c
40 42.8 ± 2.0 b 17.0 ± 2.6 a 40.2 ± 4.6 d 65.6 ± 7.2 d
45 52.1 ± 3.0 a 11.6 ± 6.0 ab 36.3 ± 4.4 d 59.1 ± 6.8 d
100 90.8 ± 1.0 8.2 ± 1.2 0.9 ± 0.3 1.5 ± 0.5
z Relative viable % = viable % at various temperature treatment/viable % at 25℃ × 100%.
y Means with different letters in the same column are significantly different (P < 0.05) by least significant difference (LSD) test.
酸鈣後花粉萌發率獲得顯著提升，‘N22’之花 區別出來 (圖 2D)，是 3種細胞染色法中較少
粉萌發率從 26.0% 提升至 76.0%，‘TN11’ 則 人為誤判與具有穩定表現之方法。Khatun &
從32.3%提升至78.7% (表2、表3)效果顯著。 Flowers (1995) 研究結果亦顯示，以 TTC 進
Steer & Steer (1989) 指出在in vitro花粉培養 行水稻花粉染色，染色率可達100%，但是觀
基中添加硝酸鈣對許多植物而言具有關鍵之作 察到加熱致死之花粉以 TTC 染色後，亦能呈
用，在本研究中亦顯示添加適當濃度之硝酸鈣， 現均一的紅色，因此對 TTC 作為分辨細胞活
具有顯著提升水稻花粉管萌發之效果 (表3)。 力的作用存疑。在本研究中則顯示，雖然TTC
花粉利用細胞染色法鑑定其活力，雖未能 染色時間已延長至 3 h，但染色率仍偏低 (表
直接證明花粉之發芽能力，但因具有快速簡單 4)，且染色之花粉細胞呈現不同程度之粉紅顏
的優點而被廣泛採用，然而各種染劑之作用機 色 (圖2B)，易產生人為之誤判。水稻花粉活
制並不相同，因此在不同物種中所呈現之染色 力檢測最常用之染劑應為 I /KI，一般將染色
2
率是否能代表花粉活力必須先加以釐清，例如 深、粒型飽滿者視為有活性之花粉，將染色淺
TTC能與正常細胞中的脫氫酶反應被還原成無 或部分染色以及形狀皺縮空扁花粉粒視為不
法透過細胞膜的紅色酯類化合物，如果細胞死 具活性之花粉 (Song et al. 2001; Saragih et al.
亡或活力衰退，則顯示未能染色或染色較淺， 2013; Ramesh et al. 2017)。Song et al. (2001)
因此可以根據染色深淺程度來分析其細胞活力 以 I /KI 染色野生稻 (Oryza rufipogon)、栽培
2
(Khatun & Flowers 1995)；非螢光且非極性之 種稻 (Oryza sativa) 以及兩者雜交種之花粉，
FDA被具有活力之細胞吸收後，可藉由活細胞 染色比率分別為 98.1、94.0 與 66.2%，但以
內之酯脢 (esterase) 將其裂解，並釋出具螢光 相同之花粉進行培養時，花粉管萌芽率則分別
物質，此時將細胞置於顯微鏡下以波長495 nm 為 58.4、84.9 與 33.9%，顯示被染色的花粉
藍光照射，可觀察到黃綠色之螢光 (Khatun & 中有相當高比例並不具備發芽之能力。本研究
Flowers 1995)；碘化鉀 (I /KI) 則能與細胞內 中將 ‘TN11’ 與 ‘N22’ 兩 (品) 種之花粉以 I /
2 2
之澱粉作用形成深藍色之碘化澱粉 (Song et al. KI 染色，染色比率皆接近95%，在本研究中
2001)。Khatun & Flowers (1995) 以 FDA 進 曾經將60℃或100℃處理10 min後之水稻花粉
行水稻花粉活力檢測，結果顯示FDA染色後 以I /KI染色，結果顯示高溫處理後之花粉經
2
呈現之螢光亮度介於中間者難以判定。在本 染色後亦呈現深褐色 (資料未顯示)，這與上述
研究中水稻花粉以FDA染色後，其黃色螢光 Khatun & Flowers (1995) 不推薦TTC之原因
在螢光顯微鏡暗視野下易於分辨，且可利用 相似，亦即以加熱致死之花粉進行染色仍可見
明視野及螢光同時開啟，將未染色之花粉細胞 其呈色，因此質疑此一染色法分辨細胞活力之
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 113300 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4499水稻花粉活力檢測方法研究 131
可信度。推測在本研究中經60℃或100℃處理 41℃) 結果亦不受影響，只要開花當日之溫度
之水稻花粉雖已不具發芽之活性，但因澱粉粒 不超過臨界高溫，穎花稔實率並不會受到高溫
仍存在於花粉細胞內，因此染色後仍可呈現出 處理的影響而下降。顯示開花期高溫對稔實率
深褐色，但此一呈色並不代表花粉具有活性。 有絕對之影響，但開花前的高溫影響較小，而
此外為確認I /KI對水稻花粉活力之鑑別力， 開花後之高溫則影響更小。水稻花粉管生長至
2
在本研究中曾取雄不稔水稻品種之花粉以I / 胚囊與受精完成分別在開花後30 min與1.5 h
2
KI 染色，結果花粉呈現淡褐色且呈現非圓形 間，亦即在高溫處理 (38℃或41℃) 前1 h所開
之不規則形狀 (資料未顯示)，證實I /KI染色 之穎花其受精已接近完成，因此稔實率之表現
2
對於雄不稔品種確有鑑別能力，但對於正常發 為正常 (Cho 1955)。研究顯示水稻以開花過程
育 (非敗育型) 花粉之活力之鑑別能力在本研 中對高溫最為敏感，整個受精的過程約1–1.5 h，
究中則有待進一步釐清。Prasad et al. (2006) 依品種不同而有所差異，大部分品種開花落在
研究亦指出I /KI染色代表花粉粒中澱粉粒之 早上9點到下午2點間，這期間的高溫將阻礙
2
累積，藉此表達花粉之活力，但並不表示具有 花粉粒膨脹與花藥囊開裂，進而影響花粉散落
澱粉粒之花粉能於柱頭發芽或具有與胚珠結合 在柱頭上之數量、阻礙花粉萌發與花粉管伸
之能力，但雄不稔品種之花粉因花粉敗育，未 長，最終造成受精率下降甚至不育。因此在水
能正常發育之花粉通常伴隨澱粉粒無法充實之 稻開花的過程中，有關穎花之開花時間、花藥
情形，故染色率低。 基部開裂之比例和長度，以及花粉的活力、柱
不同染劑對不同植物花粉活力檢測之效果 頭上之花粉數，皆可作為評估水稻受到高溫傷
並無一致性，過去的研究對於原因並未有太多 害的指標 (Matsui et al. 2000, 2001; Kumar et
探討，大多歸咎於物種本身之特性，但建議在 al. 2015)。上述研究證實花粉活力會受到溫度
使用染色法證明花粉活力前必須對其適當性加 影響，但高溫處理之水稻植株，因每株或每穗
以確認 (Firmage & Dafni 2001)。一般可利用 之發育期具有差異性，且不同穗或同一穗上之
新鮮花粉與經過加熱花粉以同一染劑進行染 穎花其發育期亦具有差異性，因此除非長時間
色，觀察染劑是否具有區別性；或利用染色法 施以高溫，否則溫度處理的影響應僅及於正在
與其他類型之花粉檢測方法如花粉培養方法交 開花之穎花，但高溫試驗之調查若以整穗、整
叉使用來確認其適當性。本研究將染色法中 株或小區產量作為樣本單位時，容易降低其關
表現較為穩定之FDA染色法與花粉培養法以 聯性，原因在於高溫影響只及於正在開花之穎
及IFC檢測法進行比較，3種方法檢測所得之 花，若能針對受影響之穎花進行調查，更能具
數據，在 ‘TN11’ 和 ‘N22’ 均顯示IFC分析結 體反應出穎花稔實率 (產量) 與高溫處理的實
果與FDA染色或花粉培養所獲得之結果在統 際關聯性，然而實務上在田間並不容易做到。
計上無顯著差異 (表5)，據此推論 IFC應可作 本研究將花藥 (粉) 從當日將開花的穎花中取
為水稻花粉活力之檢測方法。IFC原理為利用 出，施以不同溫度處理後，以 IFC 檢測花粉
多頻波之交流電通過單細胞，並將各個細胞產 活力之變化，結果顯示非耐熱品種 ‘TN11’ 之
生之電阻抗訊息加以收集，在處理數量、速度 花粉，其活力隨著溫度上升有較明顯之下降
及精準度方面，較現行大量依賴人力調查之花 (表7)，經 35℃處理之花粉活力已降至50%以
粉活力檢測方法，除節省人力外並可提高效率 下(47.4%)；而耐熱品種 ‘N22’ 之花粉活力在
(Heidmann et al. 2016)。 30–40℃處理後，花粉活力表現穩定未有明顯
Satake & Yoshida (1978) 研究指出開花當 變化，在 45℃處理後才開始明顯下降至 50%
天對穎花稔實率影響甚鉅，而在開花前1 d或 以下 (46.5%) (表6)。Satake & Yoshida (1978)
開花後1 d施以高溫處理，穎花稔實率並不會 也指出，以35℃溫度處理後獲得之稔實率，可
受到高溫處理的影響而下降，甚至在開花前 將對高溫敏感的品種區別出來，而以38℃高溫
連續 5 d 或開花後連續5 d 處理高溫 (不超過 處理則可將耐高溫品種如 ‘N22’ 與其他不耐熱
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 113311 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4499132 台灣農業研究　第71卷　第2期
品種區別出來。在本研究中 ‘TN11’ 在35℃時 引用文獻
測得之花粉活力為47.4%，相對於 25℃溫度處
Cho, J. 1955. Cytological study of double fertilization
理之花粉活力為77.3%，應不屬於對高溫敏感
in Oryza sativa L. Jpn. J. Breeding 5:131–148.
之品種，但繼續升溫至40℃時，花粉活力持續 doi:10.1270/jsbbs1951.5.131
明顯下降，顯示其亦非耐高溫品種；而 ‘N22’ Coast O., A. J. Murdoch, R. H. Ellis, F. R. Hay, and K. S.
在 35℃時測得之花粉活力為 54.1%，相對於 V. Jagadish. 2016. Resilience of rice (Oryza spp.)
pollen germination and tube growth to temperature
25℃溫度處理之花粉活力為86.8%，在 40℃時
stress. Plant Cell Environ. 39:26–37. doi:10.1111/
測得之花粉活力為53.5%，相對於 25℃溫度處 pce.12475
理之花粉活力仍高達85.9%，因此可將其歸類 Fahad S., M. Z. Ihsan, A. Khaliq, I. Daur, S. Saud, S.
於耐高溫品種，此一結果與Satake & Yoshida Alzamanan, W. Nasim, M. Abdullah, I. A. Khan, C.
Wu, D. Wang, and J. Huang. 2018. Consequences
(1978) 對 ‘N22’ 之分類相吻合。
of high temperature under changing climate optima
Rudich et al. (1977) 以著果率、花粉管萌
for rice pollen characteristics-concepts and perspec-
發率與授粉率來區分番茄品種對高溫的敏感 tives. Arch. Agron. Soil Sci. 64:1473–1488. doi:10.
性，本研究嘗試將水稻花粉施以溫度梯度處 1080/03650340.2018.1443213
理，藉由檢測花粉活力的改變來瞭解該品種花 Firmage, D. H. and A. Dafni. 2001. Field tests for pollen
viability; a comparative approach. Acta Hortic.
粉對溫度的敏感性，結果顯示耐熱之 ‘N22’ 之
561:87–94. doi:10.17660/ActaHortic.2001.561.13
花粉活力表現符合其耐熱之特性。水稻耐熱品
Heidmann, I., G. Schade-Kampmann, J. Lambalk, M.
種對高溫之反應除表現於花粉之耐熱性外，亦 Ottiger, and M. Di Berardino. 2016. Impedance
可表現在其他與生殖生長過程相關的特性，例 flow cytometry: A novel technique in pollen anal-
ysis. PLoS One 11:e0165531. doi:10.1371/journal.
如開花時花藥相對於穎苞位置，若在開花時花
pone.0165531
藥仍處於穎苞內有利於花粉散落柱頭，若花藥
Ho, C. H., C. M. Yang, C. L. Hsiao, and M. H. Lai. 2013.
已溢出穎苞則可能影響到柱頭所需之最低花粉 Changes of climatic variables during grain-filling
數；又如花藥囊在高溫時的開裂程度，同樣會 stage affect yield and quality of rice cultivars bred
from different regions in Taiwan. J. Taiwan Agric.
影響到柱頭所需之最低花粉數；又如以提早開
Res. 62:321–339. doi:10.6156/JTAR/2013.06204.03
花躲避高溫之開花型態等，以上這些特性亦有
Intergovernmental Panel on Climate Change. 2013. Sum-
助於提高授粉率，但並非藉由提高或維持花粉
mary for policymakers. p.3–29. in: Climate Change
活力來達成，育種人員在品種選育的過程中應 2013: The Physical Science Basis. Working Group I
該對這些特性加以觀察並記錄，用以綜合考評 Contribution to the Fifth Assessment Report of the
Intergovernmental Panel on Climate Change (Stock-
該品種之耐熱特性。本研究比較不同花粉活力
er, T. F., D. Qin, G. K. Plattner, M. M. B. Tignor,
檢測方法之適用性，並以 IFC 分析花粉經由 S. K. Allen, J. Boschung, A. Nauels, Y. Xia, V. Bex
不同溫度處理後活力之變化，藉由花粉活力變 and P. M. Midgley, eds.) Cambridge University
Press. Cambridge, UK. 1535 pp.
化建立不同水稻品種花粉耐溫性 (pollen ther-
Julia, C. and M. Dingkuhn. 2013. Predicting temperature
mo-tolerance) 之資料，未來將以此為基礎，
induced sterility of rice spikelets requires simula-
針對台灣目前推廣之水稻品種建立其花粉耐溫
tion of crop-generated microclimate. Eur. J. Agron.
之基本資料，作為水稻育種以及在推廣水稻品 49:50–60. doi:10.1016/j.eja.2013.03.006
種時之重要參考。 Kariya, K. 1989. Sterility caused by cooling treatment at
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臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0033 李李長長沛沛..iinndddd 113333 22002222//66//1133 下下午午 0022::2233::4499134 台灣農業研究　第71卷　第2期
Study on Detection Methods of Rice Pollen Viability
Chi-Ni Hsia1, Shuen-Chi You2, Chin-Yi Tsao3, Yong-Jie Su4, Charng-Pei Li5,*
Abstract
Hsia, C. N., S. C. You, C. Y. Tsao, Y. J. Su, and C. P. Li. 2022. Study on detection methods
of rice pollen viability. J. Taiwan Agric. Res. 71(2):123–134.
Rice is the major staple food in Taiwan, however, detrimental effects on rice grain yield and
quality by the heat stress have been observed. Since anthesis is the most sensitive stage to high tem-
perature in the rice life cycle, the viability of pollens under the heat stress will be an appropriate index
for thermo-tolerance of the variety. In addition to establishing an in vitro pollen culture medium, a
number of pollen staining methods as well as using an impedance flow cytometry (IFC) for pollen
viability analysis were conducted in this study. Fresh pollens of a japonica rice cultivar ‘Tainan 11’
(‘TN11’) and a heat-tolerant aus type rice cultivar ‘Nagina 22’ (‘N22’) were used in all experiments.
In order to establish a proper medium for pollen tube germination, the ultimate concentration of
various important components including sucrose, boric acid and calcium nitrate was investigated in
successive terms. The results showed that a medium containing 22.5% sucrose, 60 mg L-1 boric acid,
and 200 mg L-1 calcium nitrate had the highest pollen tube germination rate of 76.0% in ‘N22’ and
78.7% in ‘TN11’. Three pollen staining methods including I/KI, fluorescein diacetate (FDA), and
2
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) were compared in this study. The highest staining rate was
obtained from I/KI followed by FDA and the lowest rate was found from TTC. Three methods of in
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vitro pollen culture, FDA staining, and IFC analysis were investigated for pollen viability. Although
no difference was found among these three methods on pollen viability in ‘TN11’, FDA resulted in a
higher staining rate than the in vitro pollen culture in ‘N22’. However, there was no difference found
on IFC with the other two methods in ‘N22’. It is concluded that IFC was not different from pollen
staining or in vitro pollen culture in detecting pollen viability. Fresh pollens of the two rice cultivars
were subjected to temperature from 25℃ to 45℃ for 15 min before analyzing by IFC. The results showed
that pollen viability was significantly decreasing along with raising the temperature in ‘TN11’; however,
no significant decrease was found until 35℃, and no significant changes in pollen viability between
35℃ to 40℃ were found in ‘N22’. The results indicated that pollens of ‘N22’ had higher thermo-toler-
ance than that of ‘TN11’.
Key words: Oriza sativa L., In vitro pollen germination medium, Pollen viability, Impedance flow
cytometry.
Received: August 13, 2021; Accepted: November 30, 2021.
* Corresponding author, e-mail: charngpei@tari.gov.tw
1 Research Fellow, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
2 Assistant Research Fellow, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
3 Contract Assistant Research Fellow, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
4 Project Assistant, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
5 Associate Research Fellow, Crop Science Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
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