番茄‘花蓮亞蔬五號’以農桿菌法轉殖Bt基因之研究--材料與方法-1 - 農業知識入口網

一、植物培植體材料
取‘花蓮亞蔬五號’番茄種子無菌播種於1/2MS（半量MS元素及維生素，sucrose 30 g/L，，pH=5.7，Agar 8.5 g/L）培養基上，置於光照3600200 lux，16 hr/day，溫度25±2℃環境下，8-10天後將番茄每片子葉切成兩段長約0.2 cm左右之片段，供作感染農桿菌材料。
二、農桿菌系及質體構築與保存
將含有蘇力菌基因Cry1AC及Cry1IC之雙偶型載體pBI121經由電穿孔法轉型進入於農桿菌菌系LBA4404中（材料由中興大學陳良築教授提供）。此質體含有蘇力菌基因聯結花椰菜嵌紋病毒（CaMV）之35S啟動子及Nopaline synthase終止子（NOS terminator），另含有NPT II基因可使轉殖植物抗kanamycin。
三、植物基因轉殖方法
實驗步驟參照王和林（2007）之方法，將MSG0I感染培養基（MS元素+B5配方維生素+zeatin 1mg/L+sucrose 20g/L+acetosyringone 400μM+Glucose 10g/L，pH=5.2）與農桿菌菌液沈澱物混合均勻後稀釋至O.D.600＝0.3-0.4或0.6-0.8。將番茄‘花蓮亞蔬五號’子葉切段分別浸泡兩種菌液濃度的MSG0I培養基中30 min後，再移至共同培養基（MS元素+B5配方維生素+sucrose 20g/L+acetosyringone 400μM+zeatin 1mg/mL+Timentin 150mg/L+Agar 8.5g/L，pH=5.2）共同培養兩天，再移至再生培養基（MS元素+B5配方維生素+sucrose 20g/L+zeatin 1mg/mL＋Timentin 150mg/L，Agar 8.5g/L，pH=5.7）植株再生後移至MSTK（MS元素+B5配方維生素+sucrose 30g/L＋kanamycin 50mg/L＋Timentin 150mg/L，Agar 8.5g/L，pH=5.7）培養基繼代培養。有芽體再生時即取微量組織進行PCR檢測，續以MSTK培養基篩選生根，生根後的再生植株為擬轉殖株。對照組（Wild type）為番茄‘花蓮亞蔬五號’子葉切段經組織培養再生之植株，以上植株移至隔離溫室以14吋（43.9cm）盆種植。植株開花著果後，抽取植株葉片之DNA、RNA，進行PCR及南方、北方雜合檢測及生物檢測。