混合兩種百香果病毒 East Asian Passiflora Virus 多元抗體以提升百香果不同馬鈴薯 Y 屬病毒之廣效性檢測.pdf - 農業知識入口網

b"台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 71(2):101–121 (2022) 研究報告
DOI:10.6156/JTAR.202206_71(2).0002
混合兩種百香果病毒 East Asian Passiflora Virus 多元抗體
以提升百香果不同馬鈴薯 Y 屬病毒之廣效性檢測
陳金枝1,*　江芬蘭2　鄭櫻慧1　廖家翌2
摘要
陳金枝、江芬蘭、鄭櫻慧、廖家翌。2022。混合兩種百香果病毒East Asian Passiflora virus
多元抗體以提升百香果不同馬鈴薯Y屬病毒之廣效性檢測。台灣農業研究71(2):101–121。
罹染病毒的百香果若出現果實木質化病徵，造成畸型變小、果汁率低、風味變差，對品質與產量影響甚
大。在台灣，East Asian Passiflora virus (EAPV) AO與IB系統及Telosma mosaic virus (TeMV) 為可感染百香果
之3種主要的馬鈴薯Y屬 (Potyvirus) 病毒。本研究以細菌生合成系統分別誘導表現EAPV-AO和EAPV-IB 鞘
蛋白 (coat protein; CP) 作為抗原，經兔免疫注射後製備出具有廣效檢測19種不同馬鈴薯Y屬病毒之多元抗體，
分別稱之為Anti-EAPV-AOCP和Anti-EAPV-IBCP，並於間接式-酵素連結免疫吸附反應 (indirect enzyme-
linked immunosorbent assay; indirect ELISA) 檢測中發現以此二抗體等比例混合 (稱之為Anti-EAPVmix) 進行
檢測，也可用於檢出台灣及泰國的百香果TeMV，並提升對EAPV-AO、EAPV-IB和TeMV等3種病毒的檢
出率。應用Anti-EAPVmix檢測病毒在百香果植株枝條上之分布顯示，以近新芽之枝條上段部位葉片所測得
之病毒檢出率較高，適合作為提升檢出病毒之採樣部位。本研究顯示混合兩種EAPV的多元抗體，一次檢測
即可達到監測至少3種台灣主要的百香果Potyvirus屬病毒，並可擴及其他不同的potyvirus，且可節省檢測
所需耗材和降低成本之效益，可強化對田間百香果病毒發生的監測及健康種苗的病毒檢測內控機制。
關鍵詞：百香果potyvirus病毒、多元抗體、抗體混合液、廣效性檢測。
前言 檢測從源頭控管健康品質，乃確保百香果產值
之重要關鍵。
百香果 (Passiflora spp.) 為西番蓮科 (Passi-
國際間百香果的病毒種類，紀錄上約有20
floraceae) 西番蓮屬 (Passiflora) 的多年生蔓性
種，涵蓋Carlavirus、Cucumovirus、Cilevirus、
植物，原生於南美洲巴西等熱帶美洲地區。百
Nepovirus、Potyvirus、Rhabdovirus、Tobamo-
香果有『果汁之王』稱號，具有高經濟價值，在
virus及Tymovirus屬之病毒 (Liberato & Zerbi-
全球果汁工業上具有重要地位。「台農1號」為
ni n.d.; Spiegel et al. 2007; Parrella & Lanave
國內百香果之主力品種，以嫁接苗作為種苗繁
2009; Coutts et al. 2011; Song & Ryu 2011;
殖生產及銷售主力。國內百香果栽培面積逐年 Nakasato et al. 2020)。亞洲地區已知百香果病
增加，2020 年已達 894 ha，鮮果產量 28,526 毒種類，包括 (1) 2 種東亞百香果病毒 (East
Mg，產值達 12.8億元。但栽培過程中容易遭 Asian Passiflora virus; EAPV)：EAPV-AO
受病毒、真菌、蟲害等危害，尤以引起果實木 類群主要引起葉片嵌紋和果實木質化 (Iwai et
質化之病毒影響百香果生育及產值最鉅 (Lib- al. 2006a)；EAPV-IB 類群引起斑駁或輕微嵌
erato & Zerbini n.d.)，因此種苗之無特定病毒 紋病徵 (Chang 1992; Fukumoto et al. 2012)；
投稿日期：2021 年8月17日；接受日期：2021 年11月25日。
* 通訊作者：chinzue@tari.gov.tw
1 農委會農業試驗所植物病理組副研究員。台灣 台中市。
2 農委會農業試驗所植物病理計畫助理。台灣 台中市。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 110011 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4455102 台灣農業研究　第71卷　第2期
(2) 豇豆蚜傳嵌紋病毒 (cowpea aphid-borne 2014)；而日本、台灣、中國大陸和東南亞等
mosaic virus; CABMV)，即以往台灣學者發表 亞洲地區主要為EAPV感染所引起 (Iwai et al.
引起漣葉徵狀的百香果漣葉病毒 (passionfruit 2006b; Chong et al. 2018)；引起台灣嚴重型木
crinkle virus; PCV) (Chang & Lin 1989)；但僅 質化病徵之主要病毒為EAPV-AO系統 (Chang
於當年偶發之病例，後續未再於台灣百香果 et al. 2017; Chong et al. 2018) 和2017年發現
上發現此病毒 (Chang et al. 2017)；(3) 胡瓜嵌 之TeMV (Chen et al. 2019; Tsai 2019)。
紋病毒 (cucumber mosaic virus; CMV) 引起葉 TeMV 首次於 2008 年越南夜香花 (Telos-
片黃斑病徵 (Liberato & Zerbini n.d.)；(4) 夜香 ma cordata) 上被發現 (Ha et al. 2008)，文獻
花嵌紋病毒 (Telosma mosaic virus; TeMV 或 上紀錄的TeMV寄主包括有夜香花 (Ha et al.
TelMV) 為泰國近年於百香果上發現的病毒 2008)、廣藿香 (Pogostemon cablin) (Noveriza
(Chiemsombat et al. 2014)，引起葉片嵌紋、果 et al. 2012)、翼柄決明 (Senna alata L.) (Yao et
皮嵌紋和木質化病徵；(5) 二種 Begomovirus al. 2019) 和百香果 (Chiemsombat et al. 2014;
屬病毒：包含聖誕紅捲葉病毒 (Euphorbia leaf
Lixue et al. 2017; Chen et al. 2018b; Yang et al.
curl virus; EuLCV) 及木瓜捲葉廣東病毒 (papaya
2018)。近年於泰國 (Chiemsombat et al. 2014)
leaf curl Guangdong virus; PaLCuGDV)，首次
和中國大陸 (Lixue et al. 2017; Chen et al. 2018b;
由台灣學者報導可發生於百香果 (Cheng et al.
Yang et al. 2018; Xie et al. 2020) 陸續證實
2014)，常伴隨於寒流低溫氣候下發病而引起
TeMV 也會引起百香果木質化病徵，影響百
葉片嵌紋皺縮，氣溫回暖後新生的葉片恢復無
香果之果實品質。Lee et al. (2020) 以往於
病徵。EuLCV 在中國大陸 (Ma et al. 2004) 和
2017–2019年期間在台灣田間百香果產地的調
南韓 (Kil et al. 2016) 均有發生；PaLCuGDV
查結果顯示TeMV已普遍存在台灣田間，檢出
於2004年由中國大陸學者首次報導 (Wang et
率大約在32.1–35.8%，但仍屬零星發生。
al. 2004)，因此在中國大陸和台灣均有發生。
免疫檢測法中的酵素連結免疫吸附法 (en-
上述之 EAPV-AO、EAPV-IB、TeMV 和
zyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 應
CABMV均屬於馬鈴薯Y屬病毒 (Potyvirus) 成
用於植物病毒之檢測，具有可一次大量篩檢樣
員；近年，越南當地學者於2018年在美國國家
品的優點 (Clark & Adams 1977; Clark 1981;
生物科技資訊中心 (National Center for Bio-
Koenig & Paul 1982; Baranwal et al. 2020)。
technology Information; NCBI) 基因資料庫
近年來高靈敏度的核酸檢測技術應用，可以提
(GenBank) 登錄一種新興的馬鈴薯 Y屬病毒，
升對病毒檢測的準確度，但在田間對病毒病的
可感染當地百香果造成葉片斑駁病徵，將其
大量調查監測及產業貿易流通上的檢疫，免疫
命名為Passiflora mottle virus (PaMV) (acces-
檢測法仍為最適合者。因此，開發可提升免疫
sion no. MG087836)；然而，依照國際病毒分
檢測法的病毒多元抗體，並配合適當的取樣部
類委員會 (International Committee on Taxon-
位，可達到提升病毒檢出率的效果。
omy of Viruses; ICTV) 以全長度核酸定序為分
本研究利用細菌生合成系統分別表達
類依據，與目前已登錄於 NCBI GenBank 的
passionfruit Vietnam virus (PVNV-DakNong; EAPV-AO 和EAPV-IB的鞘蛋白 (coat protein;
accession no. MH286883) 為相同病毒 (Chong CP) 做為抗原，製備對應同源病毒之多元抗
et al. 2018; Do et al. 2021)。台灣百香果並未 體，探討其對不同百香果 potyviruses 病毒之
有此病毒發生。 檢測效果，並分析以混合兩者抗體方式進行
木質化為影響百香果生育之主因，目前國 indirect ELISA時對提升病毒檢出率的成效，
際間引起百香果木質化的病毒種類包括澳洲的 另探討 EAPV 系統的病毒在罹病植株枝條上
passionfruit woodiness virus (PWV) (Wylie & 之分布差異，以建立最適合免疫檢測的取樣部
Jones 2011)、巴西的 CABMV (Nascimento et 位，綜合免疫檢測法與適當取樣技術以提升對
al. 2006)、泰國的 TeMV (Chiemsombat et al. 百香果病毒的檢測準確度。
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材料與方法 Total RNA mini Kit, Viogene, Viogene-BioTek
Corparation, Taipei, Taiwan) 之步驟，進行供
罹染病毒之病組織
試植物組織樣品全量核醣核酸 (total RNA) 之
萃取。
台灣來源之百香果罹病組織
單步驟 RT-PCR 法：以純化所得之 RNA
本研究採用 2017–2020 年期間，由國內
為模板，利用 Potyvirus病毒之簡併式引子對
的南投埔里以及台中霧峰區和后里區田間檢出
HRP-5/Oligo-dT (5ATGATHGARKCNTG-
(14)
EAPV-AO、EAPV-IB 和TeMV之百香果葉片
GGG3/5GCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTT3)
組織，先行以反轉錄-聚合酶鏈鎖反應 (reverse
(Pappu et al. 1998; Chen et al. 2006) 進行病毒
transcription-polymerase chain reaction; RT-
基因體3端約1.3 kbp核酸片段之單步驟RT-
PCR) 確認其單獨或複合感染狀態 (Lee et al.
PCR 反應。RT-PCR 依據試劑組 (Invitrogen
2020)，作為供試材料。
Co., Carlsbad, CA, USA) 之配方，於每一25 μL
泰國來源之百香果罹病組織 反應液中分別加入1 μL之全量RNA、12.5 μL
之 2× Reaction Mix、0.5 μL 之 SuperScript III
2019年3月透過當地學者協助於泰國之曼谷
RT-/Platinum Taq Mix、各1 μL 之10 μM上游和
(Bangkok)、清邁 (Chiang Mai) 和清萊 (Chiang
下游引子，和9 μL之DEPC-treated water。所
Rai) 等地之百香果田區採取葉片嵌紋徵狀者，
有試劑混合均勻後，於熱循環反應儀 (Biome-
樣品乃透過行政院農業委員會動植物防疫檢疫
tra T3000 Thermocycler, Analytik Jena, Unter-
局之『特定植物檢疫物及物品輸入辦法』核准
schleißheim, Germany) 中進行。設定反應程序
輸入 (輸入許可證號108-V-500)，於隔離管制
為：50℃下進行反轉錄 30 min、94℃變性 2
規範條件下進行病毒鑑定之相關試驗。試驗完
min；之後進行26個PCR循環反應：94℃下變
畢依規定以高溫高壓滅菌法 (121℃、20 min)
性1 min、52℃下煉合50 s，72℃下聚合1 min
將材料進行消毒與銷毀。
30s，最後一個循環之 72℃聚合反應延長為 6
越南來源之百香果罹病組織 min。反應結果以 1.2% 電泳瓊膠 (SeaKem,
2019 年 11 月於越南之嘉萊省 (Gia Lai) Agarose, Cambrex Bio Science Rockland, Inc.,
和大叻 (Đà Lạt) 等地，在當地種苗貿易商協 Rockland, ME, USA) 進行分析判讀結果。
核酸片段選殖和核苷酸序列分析：以
助下於農民客戶種植的百香果田區採取葉片出
現嵌紋徵狀者，樣品乃透過行政院農業委員 HRP-5/Oligo-dT(14) 引子對所增幅出的1.3 kbp
會動植物防疫檢疫局之『特定植物檢疫物及物 核酸片段，選殖於 pGEM-T Easy Vector Sys-
品輸入辦法』核准輸入 (輸入許可證號108-V- tems載體上 (Promaga, Madison, WI, USA)，篩
582)，於隔離管制規範條件下進行病毒鑑定之 選出含有此特定嵌入序列 (insert sequence) 的
相關試驗。試驗完畢依規定以高溫高壓滅菌法 選殖株送交核酸定序公司 (明欣生物科技有限
(121℃、20 min) 將材料進行消毒與銷毀。 公司，台灣台北市)，以自動核酸定序儀分析
其核苷酸序列。所得序列以 Vector NTI Suite
應用細菌生合成系統表現病毒 CP 及其 (InforMax, Inc., Wisconsin, USA) 分析軟體進
多元抗體製備 行分析，並與NCBI GenBank已登錄的EAPV
本試驗使用於田間採集並以RT-PCR確認 CP核苷酸和胺基酸序列進行比對分析，確認
為單獨感染 EAPV-AO 和 EAPV-IB 的百香果 本研究病毒試驗株之CP核苷酸序列。
罹病組織進行之。
病毒分離株 CP 基因之蛋白質表現及多元
病毒CP核酸片段之選殖與定序分析 抗體製備
核酸純化：取0.1 g之受測罹病組織樣品， 依據兩種 EAPV 的 CP 序列定序結果，
依據商業化植物核酸微量萃取試劑組 (Plant 針對可增幅病毒全長度CP核苷酸序列，設計
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EAPV-AO和EAPV-IB的專一性引子對如下：(1) EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 多元抗體
AOCP-u/AOCP-d [5-TACCATGGGCAC- 之檢測效果評估
CAAATCAGAA AATGAC-3 (劃底線者為NcoI
切位)/5-CCTCGAGTCACTGCGGGGAATTCATA- EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 多元抗體對
3 (劃雙底線者為XhoI切位)]；(2) IBCP-u/IBCP-d 不同potyviruses之檢測效果
[5- ACCATGGGCTCATTCACTGGAAAAG-3 本 試 驗 參 照 前 述 indirect ELISA 方 法
(劃底線者為NcoI切位)/5-GCTCGAGTTACT- (Clark & Adams 1977; Chang et al. 1988; Chen
GCGGAGGAACCAT-3 (劃雙底線者為XhoI切 et al. 2018a) 進行受測樣品與EAPV-AOCP和
位)]；以單獨罹染 EAPV-AO 或 EAPV-IB 之 EAPV-IBCP多元抗體之反應。取0.1 g罹病葉
百香果葉片組織全量RNA為模板，參照上述 組織進行試驗。
RT-PCR 反應條件，以其對應之 CP 表現用引 Indirect ELISA法：首先以此免疫檢測法
子對，於50℃下煉合，26個PCR循環增幅， 評估本研究所自製的多元抗體之檢測效果，以
以增幅病毒之全長度CP供表現載體選殖用。 EAPV-AOCP、EAPV-IBCP 以及經等比例混
將增幅所得之 EAPV-AOCP 和 EAPV-IB- 合之 EAPV-AOCP/EAPV-IBCP (稱之為 Anti-
CP 核酸片段以 NcoI 和 XhoI 切割，剪接於 EAPVmix) 多元抗體等 3 種組合，分別稀釋
同樣經 NcoI 和 XhoI 切割之 pET28a(+) 載體 1,000× 液後，再與受測樣品進行反應，樣品
(Novagen, Inc., Madison, WI, USA)，經選殖後 來源包括 2017–2020 年於國內田間百香果田
所獲得之質體pET-EAPV-AOCP和pET-EAPV- 區採集之單獨罹染 EAPV-AO、EAPV-IB 和
IBCP 分別轉型於 Escherichia coli strain Ro- TeMV 之分離株、毛西番蓮 (Passiflora foeti-
setta (DE3) 進行表現蛋白誘導與純化，相關試 da) 分離株 EAPV-AO-PF1、泰國與越南之百
香果 potyvirus 病毒株、本研究室保存之不同
驗方法參照以往研究報告進行 (Li et al. 1998;
Potyvirus 屬病毒罹病組織 (表 1)；文獻記錄
Chen et al. 2018a)。純化後的病毒表現蛋白沉
上可感染百香果之其他種potyviruses (Fischer
澱物以pH 8.0之Tris-EDTA緩衝液溶解均勻，
& Rezende 2008; Parrella & Lanave 2009)，
並進行sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
則以本研究室保存者替代之，包括 CABMV
gel electrophoresis (SDS-PAGE) 電泳分析，再
(Chang & Lin 1989)、bean yellow mosaic
經西方墨點法 (western blotting) 以市售Poty-
virus (BYMV) (Chen et al. 1999)、Passiflora
virus單元抗體 (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA)
virus Y (PaVY 豇豆分離株) (鄭櫻慧博士提
確認帶有免疫反應之病毒CP表現株，以確認
供) 和 soybean mosaic virus (SMV 大豆分離
EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 之表現。西方墨
株)。
點法試驗步驟參照以往研究報告進行 (Chen et
取0.1 g之罹病葉組織，以 3 mL之15 mM
al. 2018a)。
碳酸鈉緩衝液 (sodium carbonate buffer, pH
進一步選用有表現EAPV-AOCP和EAPV- 9.6) 研磨均勻後，加入96孔enzyme immuno-
IBCP 之 pET 選殖株，參照以往研究報告進 assay (EIA) 反應盤內 (100 μL/孔)，進行indi-
行大量表現蛋白之誘導與純化 (Li et al. 1998; rect ELISA檢測；呈色反應以150 μL/孔之比例
Chen et al. 2018a)，將純化之表現蛋白濃縮為 加入濃度為1 mg mL-1之鹼性磷酸酶酵素基質
1 mg mL-1以做為抗原，並送交濁水溪生物科 (p-Nitrophenyl phosphate; p-NPP) (Amresco,
技有限公司 (台灣桃園市) 進行每週1次、每 Solon, OH, USA) 進行。反應30–35 min後，
次注射1 mg之純化表現蛋白，連續4 wk的兔 以ELISA讀值儀 (PTI max microplate reader,
免疫注射，第5週起由兔耳朵進行靜脈採血， Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 讀
每次採約30–40 mL以獲得多元抗體。 取波長405 nm下之吸收值，做為評估病毒濃
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 110044 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4455百香果病毒多元抗體及檢測 105
表1.　利用細菌表現之East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO和EAPV-IB融合性鞘蛋白所製備的多元抗體於
間接式酵素連結免疫吸附法檢測不同Potyvirus病毒之效果。
Table 1.　Detection effectiveness of the polyclonal antibodies against the bacterial-expressed fusion coat proteins of
East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO and EAPV-IB reacted with different potyviruses in indirect enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA).
ELISA reading (A )y
405nm
Virus-infected samplez Anti-EAPV-AOCP Anti-EAPV-IBCP Anti-EAPVmixx
East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO-Tw
EAPV-AO-Tw 1.786 1.305 1.625
EAPV-AO-PF1 1.356 0.918 1.490
EAPV-IB-Tw 1.954 2.401 2.669
Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) 0.272 0.750 0.608
Telosma mosaic virus (TeMV)
TeMV-Tw 0.592 0.849 1.101
TeMV-TL 0.602 0.808 0.892
Passionfruit Vietnam virus (PVNV)-VN 0.333 0.583 0.735
Passiflora virus Y (PaVY) 1.455 2.159 2.173
Soybean mosaic virus (SMV) 1.283 1.333 2.143
Bean yellow mosaic virus (BYMV) 0.408 1.151 1.337
Bean common mosaic virus (BCMV)-BlCM 0.795 0.922 0.819
Potato virus Y (PVY)-potato 0.582 1.015 0.673
Papaya ringspot virus (PRSV) 1.217 2.045 2.018
Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) 0.701 1.694 1.614
Maize dwarf mosaic virus (MDMV) 0.922 1.251 1.568
Butterfly flower mosaic virus (BFMV) 0.245 1.033 1.457
Ornithogalum mosaic virus (OrMV)-Or1 0.644 0.851 1.217
Turnip mosaic virus (TuMV)-YC5 0.194 0.289 0.365
Bidens mottle virus (BiMV)-Leu 0.265 0.941 1.056
Zantedeschia mild mosaic virus (ZaMMV) 0.496 1.031 0.957
Konjac mosaic virus (KoMV) 0.092 0.159 0.177
Dasheen mosaic virus (DMV) 0.063 0.147 0.115
Lycoris potyvirus 0.240 0.261 0.329
Lily mottle virus (LMoV) 0.088 0.330 0.410
D-CK 2.972 2.625 2.955
2H-CK 0.108 0.182 0.190
z Tested potyviruses are collected and preserved materials in the laboratory. TeMV-TL was collected from Thailand’s passion fruit
fields in 2019. PVNV-VN was collected from Vietnam in 2019. EAPV-AO-PF1 was collected from Passiflora foetida.
y The mean absorbance value of two replicate wells is shown. Samples with ELISA readings lower than two times of the healthy
control (2H-CK) are considered undetectable. The bacterial-expressed viral proteins are used as positive controls (D-CK).
x Anti-EAPVmix represents an equivalent mixture of Anti-EAPV-AOCP and Anti-EAPV-IBCP.
度高低之依據。樣品吸光值大於2倍之健康葉 EAPV-IB、CABMV、BYMV、PaVY、SMV
片吸光值者，判讀為正反應。 和TeMV進行反應，評估上述單獨或混合式等
另以於西方墨點法中，選用 EAPV-AO、 3種抗體組合對受測樣品的反應性。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 110055 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4455106 台灣農業研究　第71卷　第2期
病毒多元抗體檢測敏感度分析 混合液Anti-EAPVmix進行indirect ELISA檢
測試驗，評估各不同枝條部位上葉片及莖部組
本試驗分別以 EAPV-AOCP 和 EAPV-IB-
織的病毒分布差異。
CP 多元抗體，以及 Anti-EAPVmix 抗體等 3
種組合，加上以往已完成之TeMV-CP多元抗 以EAPV-AOCP和EAPV-IBCP多元抗體混
體 (Lee et al. 2020)，以稀釋 1,000× 液進行檢 合液檢測台灣田間百香果罹病樣品之效果
測敏感度之比較分析。
由上述已建立的最適當取樣部位進行採
將單獨罹染EAPV-AO、EAPV-IB和TeMV
樣，以indirect ELISA法檢測南投縣埔里大坪
之百香果罹病組織，取0.1 g組織先行以 3 mL
頂百香果栽培區之12個田區和后里1個田區
之15 mM碳酸鈉緩衝液 (sodium carbonate buf-
的百香果葉片樣品，進行病毒病發生調查。分
fer, pH 9.6) 研磨後，再以此緩衝液經5× 系列
別以 EAPV-AOCP、EAPV-IBCP 和抗體混合
稀釋至5-8的樣品液，各稀釋液分別取定量 (100
液Anti-EAPVmix等3組多元抗體進行檢測，
μL well-1) 加入96孔EIA反應盤內，每樣品加
評估對田間百香果病毒的檢出率。
2孔為2重複，進行indirect ELISA反應；最
終進行35 min之呈色反應。樣品吸光值大於2
結果
倍之健康葉片吸光值者，視為正反應。
EAPV-AOCP和EAPV-IBCP多元抗體及其 EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 融合性蛋
白表現及其多元抗體檢測評估
抗體混合液對百香果罹病組織之檢測效果
為評估以單獨 EAPV-AOCP 或 EAPV-IB- EAPV-AO 和 EAPV-IB 之 CP 表現蛋白免
CP 多元抗體及 Anti-EAPVmix 抗體對百香果 疫檢測結果：本研究針對 EAPV-AO和EAPV-
病毒罹病組織之檢出效果，本試驗將受測樣品 IB 全長度 CP 核酸片段分別所構築之 pET-
數放大，選用單獨罹染受測病毒之百香果罹 EAPV-AOCP和pET-EAPV-IBCP選殖株，在E.
病組織包括 EAPV-AO 有 23 個、EAPV-IB 有 coli Rosetta (DE3) 宿主內以1 mg mL-1之IPTG
27個和TeMV有30個；其中TeMV百香果分 (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 誘導蛋
離株包括有台灣分離株 21 個和泰國分離株 9 白質之表現，兩者均包含有部分pET28a(+) 表
個，乃分別屬於不同地理類緣關係者 (Lee et 現載體的融合性蛋白，表現蛋白分子量預估分
al. 2020)。每種受測樣品均分別與上述 EAPV- 別為 EAPV-AOCP 約為 37 kDa、EAPV-IBCP
AOCP、EAPV-IBCP 多元抗體和抗體混合液 約為 33 kDa，於 SDS-PAGE 電泳分析中均可
Anti-EAPVmix 等 3 種抗體組合進行 indirect 見其融合性表現蛋白分子量，與預估值相符且
ELISA 檢測，分析被檢出病毒的樣品數。而 為不帶有病毒核酸嵌入序列的 pET28a(+) 表
TeMV 罹病樣品則加測與 TeMV-CP 多元抗體 現載體所有 (圖1A)。於西方墨點法中，市售
(Lee et al. 2020) 之反應，以做為 TeMV-CP 多 Potyvirus 病毒的單元抗體可與 EAPV-AOCP
元抗體檢出病毒之正反應對比。 和EAPV-IBCP表現蛋白產生正反應 (圖1B)，
顯示本研究之 EAPV-AOCP和EAPV-IBCP表
以 EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 多元抗體
現蛋白均具有 Potyvirus病毒之抗原特性；進
混合液檢測百香果罹病枝條之病毒分布
一步分別以各自的表現蛋白為抗原所製成之多
檢取確認有罹染 EAPV-AO 或 EAPV-IB 元抗體，由西方墨點法分析結果，顯示可分別
之百香果枝條共51條，以新芽端起始，將枝 與其同源的表現蛋白 (EAPV-AOCP/37 kDa、
條依序劃分為上、中、下三段，分別採樣每區 EAPV-IBCP/33 kDa) 產生正反應 (圖1C)。
段上之葉片和莖部組織各 0.2 g，以 6 mL 之 EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 多元抗體對
15 mM碳酸鈉緩衝液 (pH 9.6) 研磨均勻後， 不同potyviruses的檢測效果：本研究所製備的
加入96孔EIA反應盤內 (100 μL/孔)，以抗體 EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 多元抗體，除可
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 110066 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4455百香果病毒多元抗體及檢測 107
圖1.　應用細菌大量表現的East Asian Passifl ora virus (EAPV)-AO 和 EAPV-IB融合性表現蛋白之 (A) SDS-
PAGE電泳及 (B、C) 西方墨點法分析。(A) SDS-PAGE蛋白質電泳圖，病毒鞘蛋白之融合性表現蛋白分子量
預估分別為EAPV-AO/37 kDa和EAPV-IB/33 kDa。受測樣品分別與(B) Agdia公司出品之Potyvirus單元抗體
(C) 自製之EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP多元抗體進行西方墨點法分析。行M：蛋白質分子量標幟；行pET：
細菌表現之pET28a(+) 蛋白 (未帶有病毒鞘蛋白)；行BEP：細菌表現之病毒鞘蛋白；行eBEP：純化後之細
菌表現的病毒鞘蛋白。
Fig. 1.　 (A) Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and (B, C) western blotting
assays of the bacterial-expressed coat protein (CP) of East Asian Passifl ora virus (EAPV)-AO and EAPV-IB. (A) The
bacterial-expressed fusion proteins of EAPV-AO (37 kDa) and EAPV-IB (33 kDa) (lane eBEP) were observed by
SDS-PAGE. (B) The monoclonal antibody to Potyvirus purchased from Agdia, and (C) the polyclonal antibodies to
EAPV-AO CP and EAPV-IB CP prepared in this study were used to react with the bacterial-expressed viral CPs. Lane
M: protein markers; lane pET: IPTG-induced bacterial cell lysate containing the empty vector pET28a(+); lane BEP:
IPTG-induced bacterial cell lysate containing pET28a(+) with viral CP insert; and lane eBEP: the purifi ed bacteri-
al-expressed CPs of EAPV-AO and EAPV-IB, respectively.
與其同源的融合性蛋白產生正反應外 (圖1C)； PF1分離株；(4) 記錄上可感染百香果之其他
也可於indirect ELISA法中分別與下列樣品產 種 potyviruses 包括 BYMV、CABMV、PaVY
生正反應 (表1)，包括 (1) 同源病毒之融合性 豆類分離株、SMV 及越南新興百香果病毒
蛋白 (D-CK)；(2) 百香果 EAPV-AO、EAPV- PVNV-VN；(4) 其他受測試之不同potyvirus-
IB 和 TeMV 罹病組織；TeMV 包含台灣 (Tw) es (表1)。本結果顯示所製備出之 2種EAPV
和泰國 (TL) 分離株；(3) 毛西番蓮EAPV-AO- 分離株之多元抗體，均可檢出至少19種受測
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 110077 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4466108 台灣農業研究　第71卷　第2期
試的不同potyviruses，具有廣效性檢測同屬病 抗體混合液Anti-EAPVmix對於文獻記錄上可
毒的效果。而以等比例混合的 EAPV-AOCP/ 感染百香果之不同Potyvirus屬病毒 (圖2) 包括
EAPV-IBCP多元抗體 (Anti-EAPVmix)，同樣 EAPV-AO、EAPV-IB、CABMV、BYMV、
具有廣效性檢出19種受測potyviruses樣品的 PaVY、SMV和TeMV於對應病毒CP的條帶
效果 (表1)。 上均產生正反應，顯示此等抗體於 indirect
進一步於西方墨點法分析結果顯示：本研 ELISA對上述受測樣品產生正反應者，確實是
究之EAPV-AOCP、EAPV-IBCP多元抗體及其 與受測病毒分子產生反應之結果。
圖 2.　以西方墨點法分析East Asian Passifl ora virus (EAPV)-AO 和 EAPV-IB多元抗體及其抗體混合液對不
同馬鈴薯Y屬病毒之反應。受測樣品分別與多元抗體Anti-EAPV-AOCP、Anti-EAPV-IBCP以及此兩種病毒
抗體等比例混合者 (Anti-EAPVmix) 進行反應。行M：蛋白質分子量標幟；行BEP：細菌表現之pET28a(+)
病毒鞘蛋白正對照；不同罹病組織包括：行AO (EAPV-AO)、行IB (EAPV-IB)、行CA (cowpea aphid-borne
mosaic virus; CABMV)、行Pa (Passifl ora virus Y; PaVY)、行SMV (soybean mosaic virus; SMV)、行BY (bean
yellow mosaic virus; BYMV)、行Te (Telosma mosaic virus; TeMV)；行H：健康百香果葉片組織。
Fig. 2.　Analysis of the polyclonal antibodies of East Asian Passifl ora virus (EAPV)-AO, EAPV-IB and their mix-
ture reacted to different potyviruses in western blotting assay. Samples were reacted to the antibodies of Anti-EAPV-
AOCP, Anti-EAPV-IBCP and Anti-EAPVmix (the mixture of Anti-EAPV-AOCP and Anti-EAPV-IBCP at equal
ratio), respectively. Lane M: protein markers; lane BEP, IPTG-induced bacterial cell lysate containing pET28a(+)
with viral CP insert; different virus-infected passifl ora leaf tissues including: lane AO (EAPV-AO), lane IB (EAPV-
IB), lane CA (cowpea aphid-borne mosaic virus; CABMV), lane Pa (Passifl ora virus Y; PaVY), lane SMV (soybean
mosaic virus; SMV), lane BY (bean yellow mosaic virus; BYMV) and lane Te (Telosma mosaic virus; TeMV); lane H:
the healthy passifl ora tissues.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 110088 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4477百香果病毒多元抗體及檢測 109
病毒多元抗體檢測敏感度分析 5-7，此檢測敏感度分別高於對檢測EAPV-AO
和 TeMV 的 5× 和 25× (表 2)；以抗體混合液
於indirect ELISA檢測中，以高於健康對照
的ELISA讀值 (A ) 2倍判讀為正反應之依 Anti-EAPVmix 而言，均可檢出 EAPV-AO、
405nm
據，本試驗分別以EAPV-AOCP、EAPV-IBCP EAPV-IB 和 TeMV，且可檢出各種受測病毒
多元抗體和抗體混合液 (Anti-EAPVmix) 進行 樣品的稀釋倍數至少可達到 5-6 (表 2)；本試
對檢出受測樣品的敏感度。以 EAPV-AOCP 驗另測試以往已研製的TeMV-CP多元抗體，
多元抗體而言，對其同源病毒 EAPV-AO 具 均可檢出EAPV-AO、EAPV-IB和TeMV百香
有較高之檢測敏感度，可達樣品稀釋倍數的 果罹病組織，可檢出各種受測病毒樣品的稀釋
5-8，此檢測敏感度分別高於對檢測 EAPV-IB 倍數至少可達到5-6 (表2)。本研究進一步顯示
和TeMV的5× 和25× (表2)；以 EAPV-IBCP EAPV-AOCP、EAPV-IBCP和TeMV-CP多元抗
多元抗體而言，對其同源病毒EAPV-IB 也具 體對彼此之病毒抗原均有免疫反應性，雖無法
有較高之檢測敏感度，可達樣品稀釋倍數的 做為專一性抗體，但具有廣效性檢測的成效。
表 2.　以細菌表現之East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO和EAPV-IB融合性鞘蛋白製備出之多元抗體對檢
測同源抗原和Telosma mosaic virus (TeMV) 之敏感度分析。
Table 2.　Sensitivity detection of the polyclonal antibody against bacterial expressed fusion coat proteins of East
Asian Passiflora virus (EAPV)-AO and EAPV-IB reacted to their original virus and Telosma mosaic virus (TeMV).
ELISA reading (A ) of series dilutions of antigeny
405nm
Antigenz 5-1 5-2 5-3 5-4 5-5 5-6 5-7 5-8
Reacted with Anti-EAPV-AOCP
EAPV-AO 1.254 2.198 2.097 1.442 0.590 0.251 0.116 0.106
EAPV-IB 0.733 1.692 1.542 1.043 0.725 0.164 0.097 0.039
TeMV 0.804 1.032 0.561 0.219 0.151 0.114 0.067 0.071
2H-CK 0.180 0.064 0.098 0.074 0.046 0.072 0.074 0.090
Reacted with Anti-EAPV-IBCP
EAPV-AO 0.894 1.643 1.550 1.213 0.554 0.206 0.136 0.150
EAPV-IB 1.650 2.149 2.285 2.249 1.363 0.444 0.242 0.162
TeMV 1.231 1.407 0.863 0.491 0.350 0.179 0.148 0.094
2H-CK 0.102 0.072 0.076 0.088 0.142 0.196 0.208 0.230
Reacted with Anti-TeMVCP
EAPV-AO 0.592 1.505 1.466 1.365 0.872 0.301 0.198 0.101
EAPV-IB 0.539 1.293 1.336 1.206 0.886 0.408 0.189 0.122
TeMV 2.252 2.602 2.254 1.557 1.007 0.316 0.144 0.094
2H-CK 0.144 0.060 0.068 0.070 0.100 0.108 0.178 0.162
Reacted with Anti-EAPVmixx
EAPV-AO 1.753 2.430 2.347 1.951 1.269 0.568 0.315 0.288
EAPV-IB 1.608 2.445 2.476 2.486 1.922 0.675 0.356 0.256
TeMV 1.419 1.785 1.773 0.645 0.489 0.281 0.232 0.224
2H-CK 0.058 0.046 0.064 0.098 0.166 0.182 0.334 0.360
z Tested antigens are the diseased passiflora leaves individually infected by East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO, EAPV-IB and
Telosma mosaic virus (TeMV).
y The mean absorbance value of two replicate wells is shown. Samples with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) readings
lower than two times of the healthy control (2H-CK) are considered undetectable. The underlined value means the endpoint of pos-
itive detection by tested polyclonal antibody.
x Anti-EAPVmix represents an equivalent mixture of Anti-EAPV-AOCP and Anti-EAPV-IBCP.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 110099 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4477110 台灣農業研究　第71卷　第2期
EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 多元抗體 ti-EAPVmix對檢出罹病組織上特定病毒的效
及其抗體混合液提升罹病組織病毒檢出 果，以釐清 Anti-EAPVmix 對檢測大量樣品
的實際效益。由檢測結果顯示：(1) 對檢測
率之效果
EAPV-AO罹病組織而言 (表3)，受測的 23個
本試驗以單獨感染EAPV-AO、EAPV-IB和 樣品均能以 EAPV-AOCP 多元抗體或 Anti-
TeMV之百香果罹病組織為受測對象，並放大 EAPVmix檢出，而正反應樣品的ELISA讀值平
檢測樣品數，用於評估單獨以 EAPV-AOCP 均值，則以Anti-EAPVmix檢出者為0.616，高
或 EAPV-IBCP 多元抗體、或抗體混合液An- 於單獨以EAPV-AOCP抗體檢出的0.454；若以
表3.　以indirect ELISA法和不同抗體檢測單獨罹染East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO之百香果罹病組織。
Table 3.　Detection of the East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO infected passiflora tissues by different polyclonal
antibodies in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ELISA reading (A ) of samples detected withy
405nm
EAPV-AO isolatez Anti-EAPV-AOCP Anti-EAPV-IBCP Anti-EAPVmixx
1 0.666 0.145 0.715
2 0.530 0.099 0.613
3 0.517 0.246 0.608
4 0.282 0.107 0.293
5 0.292 0.126 0.385
6 0.770 0.384 1.196
7 0.432 0.177 0.543
8 1.519 1.190 2.031
9 0.784 0.403 1.310
10 0.682 0.153 1.005
11 0.466 0.230 0.672
12 0.319 0.129 0.414
13 0.311 0.114 0.429
14 0.255 0.124 0.340
15 0.210 0.089 0.250
16 0.312 0.077 0.477
17 0.374 0.119 0.496
18 0.276 0.095 0.348
19 0.411 0.155 0.602
20 0.233 0.105 0.335
21 0.246 0.075 0.330
22 0.239 0.054 0.312
23 0.314 0.103 0.457
D-CK 2.267 2.049 2.240
2H-CK 0.184 0.186 0.206
No. positive 23 5 23
Av. positive value 0.454 0.490 0.616
z Tested antigens are the diseased passiflora leaves only infected by East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO. Positive control (D-CK)
is the bacterial expressed viral protein.
y The mean absorbance value of two replicate wells is shown. Samples with ELISA readings lower than two times of the healthy
control (2H-CK) were considered undetectable by indirect ELISA.
x Anti-EAPVmix represents an equivalent mixture of Anti-EAPV-AOCP and Anti-EAPV-IBCP.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 111100 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4477百香果病毒多元抗體及檢測 111
EAPV-IBCP多元抗體檢測，則僅檢出5個樣品， mix檢出，而正反應樣品的ELISA讀值平均
正反應樣品讀值之平均值為0.490；(2) 對檢測 值，則以 Anti-EAPVmix 檢出者為 1.604，高
EAPV-IB罹病組織而言 (表4)，受測的 27個樣 於單獨以EAPV-IBCP抗體檢出的1.333；若以
品均能以EAPV-IBCP多元抗體或Anti-EAPV- EAPV-AOCP多元抗體檢測，則僅檢出26個樣
表4.　以indirect ELISA法和不同抗體檢測單獨罹染East Asian Passiflora virus (EAPV)-IB之百香果罹病組織。
Table 4.　Detection of the East Asian Passiflora virus (EAPV)-IB infected passiflora tissues by different polyclonal
antibodies in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ELISA reading (A ) of samples detected withy
405nm
EAPV-IB isolatez Anti-EAPV-IBCP Anti-EAPV-AOCP Anti-EAPVmixx
1 1.975 1.385 2.181
2 0.806 0.450 1.067
3 0.806 0.453 1.223
4 0.461 0.282 0.785
5 0.903 0.558 1.350
6 1.383 0.897 1.740
7 2.245 1.397 2.398
8 2.075 1.157 2.216
9 1.233 1.004 1.404
10 2.163 1.636 2.210
11 1.513 0.867 1.742
12 0.508 0.495 1.058
13 1.758 1.780 1.585
14 1.190 0.985 1.802
15 1.597 0.967 2.174
16 1.276 0.639 1.443
17 1.838 1.210 1.431
18 0.852 0.667 1.066
19 0.888 0.751 1.376
20 1.023 0.952 1.617
21 0.853 0.712 1.514
22 1.440 0.999 2.094
23 1.466 0.850 1.658
24 2.150 1.992 2.398
25 2.052 1.232 1.751
26 1.550 0.813 1.726
27 0.168 0.168 0.286
D-CK 2.317 2.992 2.386
2H-CK 0.145 0.168 0.206
No. positive 27 26 27
Av. positive value 1.333 0.967 1.604
z Tested antigens are the diseased passiflora leaves only infected by East Asian Passiflora virus (EAPV)-IB. Positive control (D-CK)
is the bacterial expressed viral protein.
y The mean absorbance value of two replicate wells is shown. Samples with ELISA readings lower than two times of the healthy
control (2H-CK) were considered undetectable by indirect ELISA.
x Anti-EAPVmix represents an equivalent mixture of Anti-EAPV-AOCP and Anti-EAPV-IBCP.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 111111 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4477112 台灣農業研究　第71卷　第2期
品，讀值平均值為0.967；(3) 對檢測TeMV罹 共 387 個受檢樣品，結果顯示以抗體混合液
病組織而言 (表5)，受測的 30個樣品中 (包含 Anti-EAPVmix可檢出321個樣品罹染病毒，
21個台灣分離株和9個泰國分離株)，均能以 均高於單獨以 EAPV-AOCP 抗體檢出數 302
TeMV-CP多元抗體或抗體混合液Anti-EAPV- 個和以EAPV-IBCP抗體檢出數274個，顯示
mix 檢出，其正反應樣品的 ELISA 讀值平均 抗體混合法可檢出更多罹染病毒的樣品數 (表
值，則以TeMV多元抗體檢出者的1.452，高 7)，對田間百香果病毒發生調查有提升檢出病
於以 Anti-EAPVmix 檢出之 0.628；若單獨以 毒準確度的效果。
EAPV-AOCP或EAPV-IBCP多元抗體做檢測，
則檢出之樣品數分別為19和16個，無法全數 討論
檢出TeMV。
本研究為台灣首度完成以細菌生合成系統
本試驗結果進一步顯示，對田間罹染病毒的
誘導表現百香果病毒EAPV-AOCP和EAPV-IB-
百香果罹病組織而言，在放大受檢樣品數時，以抗
CP做為抗原，製備出具有廣效檢測不同馬鈴
體混合液Anti-EAPVmix均可檢出EAPV-AO、
薯Y屬病毒之多元抗體，並印證以此兩種多元
EAPV-IB 和 TeMV，且對 EAPV-AO 和 EAPV-
抗體混合使用可提升對同源病毒及其他百香果
IB的檢測，有優於單獨以個別抗體檢測的效果；
Potyvirus病毒的檢測效率，除了可簡化免疫檢
此外，本抗體混合液均可檢出台灣和泰國的百
測法的操作及節省成本外，對於田間百香果病
香果TeMV分離株，有達到以非同源抗體進行
毒發生調查鑑定也可做為替代性的多元抗體使
替代性檢測不同類病毒的效果。
用，尤其用於廣效檢測 EAPV-AO、EAPV-IB
以EAPV-AOCP和EAPV-IBCP多元抗體 和TeMV而提升檢出病毒的準確度；進一步以
indirect ELISA法探討EAPV病毒在百香果枝
混合液檢測百香果罹病枝條之病毒分布
條不同部位為不均勻分布，並掌握可提升檢出
本研究探討以抗體混合液Anti-EAPVmix
病毒之取樣部位，整體技術可提升以免疫檢測
檢測百香果枝條上、中、下三區段內之葉片和
百香果potyviruses的效益。
莖部採樣對檢出病毒的影響，檢測罹染EAPV- EAPV-AO和EAPV-IB為亞洲常見的百香
AO 或 EAPV-IB 共 51 個枝條的結果顯示： 果病毒 (Iwai et al. 2006b; Chang et al. 2017;
無論是取樣哪個區段的受測組織，以採取葉
Chong et al. 2018)；在台灣，引起嚴重型木質
片組織做檢測，所獲得的ELISA 正反應讀值 化病徵主要為EAPV的AO系統 (Chong et al.
平均 (A405nm) (約 1.159–1.421) 均高於各區段 2018)，影響百香果品質甚鉅，因此在百香果
的莖部組織檢測值 (約 0.727–0.907)，尤其以 種苗產業上被高度重視；此2種病毒，在台灣
上段區域內的葉片 (含新葉) 之病毒檢出率最 於2016年行政院動植物防疫檢疫局公告實施
高，達92.1%；其他各部位的病毒檢出率介於 為『百香果種苗病害驗證作業須知』之標的病
68.6–78.4% (表 6)。 毒。近年來 TeMV 在泰國、中國大陸和台灣
的百香果田間發生，也會引起百香果木質化病
以 EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 多元抗
徵 (Lixue et al. 2017; Yang et al. 2018; Lee et
體混合液檢測不同田區百香果罹病樣品
al. 2020; Xie et al. 2020)，筆者等人近年來調
之效果
查 TeMV 在台灣百香果產地的檢出率大約在
由上述已建立的 EAPV-AOCP/EAPV-IB- 32.1–35.8%，顯示 TeMV已普遍存在台灣田間
CP抗體混合檢測法，以及最適當的枝條上段 (Lee et al. 2020)。本研究為提升以免疫檢測
葉片取樣部位為基礎，以 indirect ELISA 法 法對EAPV-AO、EAPV-IB和TeMV等百香果
檢測進行田間不同百香果田區的病毒發生調 病毒之檢出效率，除以往已完成TeMV多元抗
查。由埔里大坪頂 12個田區和后里 1個田區 體製備與免疫檢測應用外 (Lee et al. 2020)，
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 111122 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4477百香果病毒多元抗體及檢測 113
表5.　以indirect ELISA法和不同抗體檢測單獨罹染Telosma mosaic virus (TeMV) 之百香果罹病組織。
Table 5.　Detection of the Telosma mosaic virus (TeMV)-infected passiflora tissues by different polyclonal antibod-
ies in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ELISA reading (A ) of samples detected withy
405nm
TeMV isolatez Anti-TeMVCP Anti-EAPV-AOCP Anti-EAPV-IBCP Anti-EAPVmixx
Tw 1 2.037 0.348 0.300 0.634
Tw 2 1.186 0.214 0.236 0.428
Tw 3 1.023 0.090 0.112 0.251
Tw 4 1.511 0.539 0.249 0.898
Tw 5 1.407 0.153 0.179 0.299
Tw 6 1.920 0.437 0.343 0.647
Tw 7 1.746 0.310 0.135 0.461
Tw 8 1.279 0.405 0.459 0.589
Tw 9 1.618 0.216 0.110 0.430
Tw 10 1.647 0.358 0.178 0.682
Tw 11 0.992 0.203 0.115 0.370
Tw 12 2.060 0.479 0.455 0.738
Tw 13 1.672 0.256 0.247 0.390
Tw 14 1.025 0.123 0.142 0.310
Tw 15 1.382 0.215 0.136 0.415
Tw 16 1.530 0.202 0.105 0.607
Tw 17 1.351 0.158 0.128 0.299
Tw 18 1.683 0.398 0.184 0.732
Tw 19 1.473 0.652 0.246 1.035
Tw 20 2.240 0.824 0.883 1.223
Tw 21 1.789 1.084 0.722 1.507
TL1 1.334 0.643 0.398 1.019
TL3 1.062 0.237 0.421 0.681
TL5 1.408 0.367 0.165 0.695
TL6 0.894 0.329 0.311 0.694
TL7 1.790 0.651 0.380 1.055
TL8 1.666 0.446 0.579 0.880
TL9 1.763 0.729 0.411 0.788
TL14 0.599 0.114 0.072 0.304
TL15 0.461 0.073 0.076 0.392
D-CK 2.060 2.163 2.150 2.031
2H-CK 0.182 0.214 0.172 0.180
No. positive 30 19 16 30
Av. positive value 1.452 0.500 0.415 0.628
z Tested antigens are the diseased passiflora leaves only infected by Telosma mosaic virus (TeMV), sample Tw 1–21 are Taiwan iso-
lates and TL is Thailand isolates. Positive control (D-CK) is the bacterial expressed viral protein.
y The mean absorbance value of two replicate wells is shown. Samples with ELISA readings lower than two times of the healthy
control (2H-CK) are considered undetectable. The bacterial-expressed viral proteins are used as positive controls (D-CK).
x Anti-EAPVmix represents an equivalent mixture of Anti-EAPV-AOCP and Anti-EAPV-IBCP.
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表6.　應用多元抗體混合法於indirect ELSIA檢測百香果枝條不同部位之病毒分布。
Table 6.　Detection of the viruses on different portions of passiflora branches by the mixture of polyclonal antibodies
against East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO and EAPV-IB in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELI-
SA).
ELISA reading (A ) of different portions on shooty
405nm
Stem Leaf
Samplez Upper Middle Lower Upper Middle Lower
1 0.955 1.455 0.969 1.436 1.660 2.654
2 0.748 2.145 0.033 1.055 2.407 2.500
3 0.338 0.120 0.094 1.321 1.851 2.153
4 0.222 0.045 0.083 2.515 2.066 1.773
5 0.223 1.268 1.916 1.595 2.129 2.401
6 1.316 1.057 0.159 1.767 2.361 2.635
7 2.235 0.945 0.634 1.625 1.537 2.062
8 0.727 1.818 1.157 1.676 1.812 2.083
9 1.525 2.040 0.884 2.512 0.214 2.465
10 1.252 1.061 1.415 1.906 1.890 1.028
11 1.743 2.634 0.588 2.047 0.070 0.579
12 1.626 0.089 0.389 2.267 2.360 2.362
13 0.044 0.037 0.122 0.365 0.114 1.743
14 0.548 1.210 0.494 1.149 2.336 1.810
15 1.286 1.717 1.731 2.302 1.749 2.309
16 0.038 0.059 0.624 0.042 1.209 1.093
17 0.156 0.273 0.614 1.081 1.777 1.519
18 0.951 0.218 0.170 2.030 1.518 1.872
19 2.157 1.956 1.760 1.977 0.380 0.414
20 0.427 0.930 0.121 1.306 0.144 1.295
21 0.808 0.750 0.785 0.807 0.040 0.317
22 0.701 1.112 0.948 1.545 0.075 0.399
23 1.146 1.171 0.770 1.206 0.285 0.136
24 0.572 0.507 0.374 0.330 0.219 0.279
25 1.383 0.635 1.210 0.306 0.203 0.116
26 0.585 0.094 0.123 0.246 0.763 0.217
27 0.427 0.521 0.196 0.762 0.934 1.071
28 0.400 0.244 0.093 1.143 1.539 1.264
29 0.139 0.103 0.081 0.941 1.393 1.194
30 0.435 0.493 0.817 0.689 0.064 0.065
31 0.602 0.265 0.258 1.068 0.876 1.494
32 0.474 0.481 0.388 0.971 0.214 0.127
33 0.041 0.149 0.105 0.357 0.084 0.073
34 1.310 0.367 0.157 1.416 0.811 0.078
35 0.071 0.850 0.237 0.141 0.594 0.161
36 0.465 0.168 0.197 0.592 0.074 0.046
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 111144 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4488百香果病毒多元抗體及檢測 115
表6.　應用多元抗體混合法於indirect ELSIA檢測百香果枝條不同部位之病毒分布。(續)
Table 6.　Detection of the viruses on different portions of passiflora branches by the mixture of polyclonal antibodies
against East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO and EAPV-IB in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELI-
SA). (continued)
ELISA reading (A ) of different portions on shooty
405nm
Stem Leaf
Samplez Upper Middle Lower Upper Middle Lower
37 1.426 0.655 0.305 0.273 1.265 0.116
38 0.090 1.105 0.209 0.336 0.599 0.145
39 0.453 0.149 0.166 0.579 0.074 0.067
40 1.386 0.611 0.218 1.229 0.260 0.071
41 0.889 0.268 0.380 1.167 1.286 0.122
42 0.232 0.345 1.081 1.097 0.855 1.628
43 0.206 0.217 0.652 0.495 0.983 1.206
44 1.112 0.770 0.499 0.658 0.040 0.040
45 0.131 0.049 1.139 0.481 0.047 0.583
46 0.263 0.503 0.206 1.189 0.628 1.068
47 0.330 0.130 0.192 0.788 1.414 1.088
48 0.676 1.124 0.438 1.121 0.045 0.038
49 0.025 0.028 0.609 0.029 0.158 0.931
50 0.087 0.426 0.216 0.166 0.990 0.252
51 0.129 0.346 0.530 0.741 0.353 0.057
No. positive 40 38 35 47 38 35
% positive 78.4 74.5 68.6 92.1 74.5 68.6
Av. positive value 0.864 0.907 0.727 1.159 1.203 1.421
z Tested samples are the diseased passiflora leaves infected by East Asian Passiflora virus (EAPV)-AO, EAPV-IB or telosma mosaic
virus (TeMV).
y The mean absorbance value of two replicate wells is shown. Samples with ELISA readings lower than two times of the healthy
control (2H-CK) are considered undetectable. The bacterial-expressed viral proteins are used as positive controls (D-CK). An-
ti-EAPVmix represents an equivalent mixture of Anti-EAPV-AOCP and Anti-EAPV-IBCP was used for reaction.
於本研究中開發以細菌生合成系統誘導表現 2017) 及百香果 TeMV (Lee et al. 2020) 等病
EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 做為多元抗體製 毒之檢測試劑製備，藉此技術可實用於開發不
備的抗原來源。由本研究結果顯示所獲得對應 同來源病毒的檢測試劑，達到強化自主檢疫監
EAPV-AOCP 和 EAPV-IBCP 的多元抗體，除 測重要作物病毒的能力。
了可有效檢測個別的同源病毒抗原外，也具有 病毒多元抗體使用於免疫反應中容易產生
對其他百香果和花卉等 potyviruses (表 1) 的 非專一性的結果 (Shukla et al. 1988; Jordan &
廣效性檢出效果。利用表現載體之細菌生合成 Hammond 1991)，乃因抗原免疫過程中，因為
系統獲得病毒CP抗原，可突破病毒罹病檢體 所對應同一分子的不同抗原決定基 (antigenic
缺乏或病毒純化不易的瓶頸，而成功製備出可 determinants) 而產生 (Souiri et al. 2014)；尤其
有效檢測特定病毒之多元抗體與正對照品，進 以全長度CP為抗原所製備出的多元抗體，更
而掌握對特定病毒之檢測鑑定能力，此策略以 容易導致對特定病毒的非專一性反應 (Shepard
往已見諸對台灣尚未發生之蘭花病毒Cymbid- et al. 1974; Shukla et al. 1989)，多元抗體因
ium ringspot virus (CymRSV) (Chen & Chiang 此可針對不同病毒達到廣效性檢測的效果。廣
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 111155 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4488116 台灣農業研究　第71卷　第2期
表7.　以indirect ELISA法和不同抗體檢測田間百香果罹染病毒之檢出數。
Table 7.　Field survey by detection of the passiflora viruses with the different polyclonal antibodies in indirect en-
zyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
No. of samples positively detected by indirect ELISAy
Fieldz Tested no. samples Anti-EAPV-AOCP Anti-EAPV-IBCP Anti-EAPVmix
Puli 1 40 30 31 36
Puli 2 15 12 10 12
Puli 3 30 28 9 28
Puli 4 5 5 5 5
Puli 5 32 9 6 11
Puli 6 50 43 42 47
Puli 7 27 23 22 23
Puli 8 39 31 30 33
Puli 9 22 11 11 11
Puli 10 29 28 27 28
Puli 11 23 21 22 22
Puli 12 28 19 18 20
Houli 47 42 41 45
Total no. 387 302 274 321
z Tested sapmples were collected from different passiflora fields located in Puli, Nantou County and Houli, Taichung City, Taiwan.
y No. of the virus positively detected samples was conducted by the in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (indirect ELI-
SA) by the polyclonal antibody against East Asian Passiflora virus (EAPV)-AOCP, EAPV-IBCP and the mixture of EAPV-AOCP/
EAPV-IBCP (Anti-EAPVmix) at equal ratio, respectively.
效性免疫檢測對檢測植物病毒而言，具有降 興病毒PVNV (表1)，具有高度檢出對不同來
低成本與提升對不同病毒 (或未知病毒) 同時 源的同屬病毒之潛力；而若改以抗體混合液
檢出效率的優點，在國內外的研究上目前大 Anti-EAPVmix進行檢測，同樣具有廣效性檢
多以2種或以上的病毒CP基因重組後，同時 出19種受測potyviruses樣品的效果，尤其於
構築於表現載體上，再利用細菌表現融合性重 EAPV-AO、EAPV-IB 和 TeMV 罹病組織的稀
組蛋白的方式以獲得多重抗原來源，以製備 釋倍數達 5-6時，仍均可以抗體混合液 Anti-
可廣效性檢測不同類病毒之抗體，相關成功 EAPVmix 檢出 (表 2)；此外，若擴展到田間
的研究包括有可同時檢測瓜類或茄科病毒cu- 大量罹病樣品的檢測時，對病毒的檢出率以
cumber mosaic virus (CMV)、papaya ringspot 抗體混合法均有優於以單一種病毒抗體做檢測
virus (PRSV) 和 groundnut bud necrosis virus 的效果 (表3、表4、表7)，顯見本研究所使用
(GBNV) (Kapoor et al. 2014a)；可同時檢測馬 的 EAPV-AOCP/EAPV-IBCP 抗體混合檢測方
鈴薯病毒 potato virus Y (PVY) 和 PVX (Ka- 式，具有提升對百香果不同potyviruses廣效性
poor et al. 2014b) 的多元抗體等。 檢測的成效，更可節省檢測耗材使用與成本。
本研究以單獨表現EAPV-AOCP或EAPV- 病毒感染作物後，在植物體各部位組織內
IBCP的融合性蛋白做為抗原而個別製備出之 通常為不均勻分布 (Chen et al. 1999; Chen et al.
對應抗體，本身即具有可同時檢測多種poty- 2013)，因此以免疫檢測法檢測病毒時，須配合
viruses的效果 (表1、圖2)；在百香果病毒方 適當的取樣部位以提升檢出準確度，例如筆者
面，包括可檢出常見的 EAPV-AO、EAPV-IB 以往已報告由百合種球或植株根系取樣檢測可
和TeMV，更可擴及毛西番蓮的 EAPV-AO分 穩定檢出Plantago asiatica mosaic virus (PlAMV)
離株、泰國 TeMV 分離株和越南的百香果新 病毒且獲得高檢出率 (Chen et al. 2013)。本研
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 111166 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4488百香果病毒多元抗體及檢測 117
究以 EAPV-AOCP/EAPV-IBCP 多元抗體混合 引用文獻
法檢測田間罹染有 EAPV-AO 或 EAPV-IB 的
Baranwal, V. K., R. Kapoor, S. Kumar, and N. Srivastava.
百香果枝條，依其不同部位的葉片或莖部組織
2020. Recent advances of virus diagnostics in horti-
檢測病毒結果，可於近新芽區段的完全展開葉 cultural crops. p.27–37. in: Applied Plant Virology:
片檢出更高比例的病毒，顯示此區段上的葉片 Advances, Detection, and Antiviral Strategies.
(Awasthi, L. P., ed.) Academic Press. London, UK.
更適合用於做為病毒檢測的取樣部位；此對於
821 pp. doi:10.1016/B978-0-12-818654-1.00002-5
建立百香果病毒檢測準確度上，除可應用抗體
Chang, C. A. 1992. Characterization and comparison of
混合法同時檢測可能的百香果不同potyviruses
passionfruit mottle virus, a newly recognized poty-
時，簡化檢測用抗體種類和節省成本外，更可 virus, with passionfruit woodiness virus. Phytopa-
採樣適當部位達到以免疫檢測提升病毒檢出率 thology 82:1358–1363. doi:10.1094/Phyto-82-1358
的成效。 Chang, C. A., E. Hiebert, and D. E. Purcifull. 1988.
Purification, characterization, and immunological
本研究發現以 EAPV-AOCP/EAPV-IBCP
analysis of nuclear inclusions induced by bean
抗體混合方式可達到檢出台灣和泰國TeMV百 yellow mosaic and clover yellow vein potyviruses.
香果分離株的效果 (表1、表5)，其重要意義 Phytopathology 78:1266–1275. doi:10.1094/Phy-
to-78-1266
在於泰國TeMV分離株與台灣分離株在CP胺
Chang, C. A. and H. H. Lin. 1989. Passionfruit crinkle
基酸的相同度比較分析中，具有不同地理位置
virus, a new potyvirus isolated from passionfruit in
之類緣差異 (Lee et al. 2020)，仍可以本研究 Taiwan. Plant Prot. Bull. 31:409–410.
之免疫檢測方法檢出；此外，也可檢出越南新
Chang, C. A., L. C. Huang, Y. C. Chen, Y. Y. Lin, H.
興的百香果病毒PVNV (Chong 2018) (表 1)。 C. Lu, and Y. D. Lin. 2017. A review of the re-
本研究所應用之抗體混合法可一次檢出潛在的 search and control of passionfruit virus diseases
in Taiwan. J. Plant Med. 59(3):1–12. doi:10.6716/
EAPV-AO、EAPV-IB、TeMV 和 PVNV 等 不
JPM.201709_59(3).0001
同百香果potyviruses (表1)，可提升對田間監
Chen, C. C., C. A. Chang, and T. Dai. 1999. Variable dis-
測不同 potyviruses 發生概況的效益，尤其對 tribution patterns of bean yellow mosaic potyvirus
大量調查與篩檢不同地理位置之同類病毒具有 and cucumber mosaic cucumoviruses in gladiolus
plant and their influence on virus detection. Plant
相當高之應用潛力。而對於亞洲不同地理位置
Pathol. Bull. 8:117–120. (in Chinese with English
上之百香果 EAPV-AO、EAPV-IB、TeMV 或 abstract) doi:10.6649/PPB.199909_8(3).0005
其他種 potyviruses 檢測，未來若能收集更多 Chen, C. C., H. T. Hsu, Y. H. Cheng, C. H. Huang, J. Y.
的國際百香果 potyviruses 進行檢測試驗，則 Liao, H. T. Tsai, and C. A. Chang. 2006. Molecular
可進一步對於本研究所研製的百香果病毒抗體 and serological characterization of a distinct potyvi-
rus causing latent infection in calla lilies. Bot. Stud.
之檢測廣度有更明確的成效評估。
47:369–378.
Chen, C. C., Y. L. Jhang, B. Y. Lin, F. L. Chiang, Y. H,
誌謝 Cheng, and T. C. Deng. 2013. Serological reagent
preparation and improvement of serological meth-
本試驗承本組病毒研究室助理黃美容小姐 od for the detection of Plantago asiatica mosaic
協助多元抗體檢測試驗；農業試驗所退休研究 virus in lily. J. Taiwan Agric. Res. 62:268–279.
(in Chinese with English abstract) doi:10.6156/
人員張清安博士保存於本實驗室之百香果PCV
JTAR/2013.06203.07
(同CABMV) 材料；行政院農業委員會動植物
Chen, C. C. and F. L. Chiang. 2017. Development and ap-
防疫檢疫局106年百香果重要病毒檢測試劑套 plication of the molecular and serological detection
組開發應用計畫 [106 農科 -9.4.1-檢-B3 (1)] methods for Cymbidium ringspot virus. J. Taiwan
和行政院農業委員會 107 年度農業研發成果 Agric. Res. 66:202–218. (in Chinese with English
abstract) doi:10.6156/JTAR/2017.06603.04
跨域整合創新加值與產業化應用計畫 (MOST
Chen, C. C., F. L. Chiang, and C. H. Huang. 2018a. Mo-
107-3111-Y-067E-016) 之經費補助，謹此一併
lecular and serological identification of Gloriosa
致謝。 stripe mosaic virus on Christmas bells (Sandersonia
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((22))--0022 陳陳金金枝枝..iinndddd 111177 22002222//66//1100 上上午午 1100::5522::4488118 台灣農業研究　第71卷　第2期
aurantiaca Hook). J. Taiwan Agric. Res. 67:229– 20-0481-R
246. (in Chinese with English abstract) doi:10.6156/
Fischer, I. H. and J. A. M. Rezende. 2008. Diseases of
JTAR.201809_67(3).0001
passion flower (Passiflora spp.). Pest Technol.
Chen, C. C., F. L. Chiang, C. M. Hsu, and M. R. Huang. 2(1–2):1–19.
2019. Development and application of nucleic acid
Fukumoto, T., M. Nakamura, M. Rikitake, and H. Iwai.
detection technology for East Asian Passiflora virus
2012. Molecular characterization and specific de-
and Telosma mosaic virus. J. Plant Med. 61(2–3):73.
tection of two genetically distinguishable strains of
(in Chinese)
East Asian Passiflora virus (EAPV) and their distri-
Chen, S., N. Yu, S. Yang, B. Zhong, and H. Lan. 2018b. bution in southern Japan. Virus Genes 44:141–148.
Identification of Telosma mosaic virus infection in doi:10.1007/s11262-011-0676-7
Passiflora edulis and its impact on phytochemical con-
Ha, C., S. Coombs, P. A. Revill, R. M. Harding, M. Vu,
tents. Virol. J. 15:168. doi:10.1186/s12985-018-1084-6
and J. L. Dale. 2008. Design and application of two
Cheng, Y. H., T. C. Deng, C. C. Chen, C. H. Chiang, and
novel degenerate primer pairs for the detection and
C. A. Chang. 2014. First report of Euphorbia leaf
complete genomic characterization of potyviruses.
curl virus and Papaya leaf curl Guangdong virus
Arch. Virol. 153:25–36. doi:10.1007/s00705-007-
on passion fruit in Taiwan. Plant Dis. 98:1746.
1053-7
doi:10.1094/PDIS-05-13-0554-PDN
Iwai, H., R. Terahara, Y. Yamashita, S. Ueda, and M.
Chiemsombat, P., S. Prammanee, and N. Pipattanawong.
Nakamura. 2006a. Complete nucleotide sequence
2014. Occurrence of Telosma mosaic virus causing
of the genomic RNA of an Amami-O-Shima strain
passion fruit severe mosaic disease in Thailand and
of East Asian Passiflora potyvirus. Arch. Virol.
immunostrip test for rapid virus detection. Crop
151:1457–1460. doi:10.1007/s00705-006-0779-y
Prot. 63:41–47. doi:10.1016/j.cropro.2014.04.023
Iwai, H., Y. Yamashita, N. Nishi, and M. Nakamura.
Chong, Y. H. 2018. Characterization of passionfruit-in-
2006b. The potyvirus associated with the dappled
fecting viruses in Taiwan and Vietnam and gener-
fruit of Passiflora edulis in Kagoshima prefecture,
ation of cross-protection effective mild strains of
Japan is the third strain of the proposed new species
East Asian Passiflora virus. Doctoral Dissertation.
East Asian Passiflora virus (EAPV) phylogenetical-
Department of Plant Pathology, National Chung Hs-
ing University. Taichung, Taiwan. 163 pp. ly distinguished from strains of Passion fruit wood-
iness virus. Arch. Virol. 151:811–818. doi:10.1007/
Chong, Y. H., Y. H. Cheng, H. W. Cheng, Y. C. Huang,
s00705-005-0659-x
and S. D. Yeh. 2018. The virus causing passion-
fruit woodiness disease in Taiwan is reclassified as Jordan, R. and J. Hammond. 1991. Comparison and dif-
East Asian Passiflora virus. J. Gen. Plant Pathol. ferentiation of potyvirus isolates and identification
84:208–220. doi:10.1007/s10327-018-0777-4 of strain-, virus-, subgroup-specific and potyvirus
group-common epitopes using monoclonal anti-
Clark, M. F. 1981. Immunosorbent assays in plant patholo-
bodi