利用分子標誌輔助研發低消化性蛋白之水稻品種--材料與方法-2 - 農業知識入口網

三、Lgc1專一性分子標誌基因型分析
根據Morita等人(2009)針對Lgc1突變開發專一性分子標誌，在一般型及突變型各別設計一組專一性分子標誌引子對(表一)，該引子對針對3.5 kb缺失片段上，以及缺失片段兩端設計引子對，並控制PCR條件延伸(extension)時間，以避免擴增目標以外之條帶，其擴增片段示意圖及擴增片段分子量大小如圖一所示(Morita, et al. 2009)，PCR 反應體積為20 μl，內含1 unit Taq DNA 聚合酶（Invitrogen）、1×PCR buffer、1.5 mM MgCl₂、0.2 mMdNTP、0.8 mM引子及40 ng DNA 模板，PCR儀器為96-Well GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems），溫度設定為94℃5 min，再進行42次的94℃30 s，53-57℃40 s，72℃110 s，最後進行72℃7 min；將反應後之產物以電泳進行分析。
表一、本研究所使用之引子對序列
Table 1. Nucleotide sequences of the primers used in this study.

Primer	Sequence (5'-3')
LGCd-F2	CGGGTAAAGAATGGCCTTAAAC
LGCd-R2	ATTTGGTCATACTAGTCTAGTT
LGCw-F	GCAAGCACGAAGCCTTAAGA
LGCw-R	TGAGTCCACAGTTGATTGCT

(Morita et al., 2009)
圖一、Lgc1突變專一性PCR分子標誌之設計