利用分子標誌輔助研發低消化性蛋白之水稻品種--材料與方法-3 - 農業知識入口網

四、DNA電泳分析
經專一性分子標誌分析之20 μl PCR反應產物加入4 μl 的6×DNA loading dye，以2% agarose (LE)膠體，0.5×TBE (45 mM Tris-HCl, pH 8.3, 45 mM boric acid, 1 mM EDTA，pH7)的電泳緩衝液進行DNA 電泳，電泳槽為BIO-RAD sub Cell (G7)，電壓110V，電泳時間約90-100 min，結束後置於0.5 mg·ml^-1 的Ethidium bromide (溶於0.5×TBE buffer)中染色20 min，並以清水退染約10 min，再置於紫外燈箱中，檢視膠體上DNA多型性片段，並利用Gel catcher1200 影像系統公司照相，以進行DNA條帶之分析、基因型判讀。
五、SDS-PAGE蛋白質電泳及蛋白質含量比例分析
各品系與兩親本全蛋白質的萃取，將各品系碾製成白米後以高速震盪均質器(KURABO SH-100)進行磨粉，均質完成後每品系各取0.1 g加入1 ml的種子蛋白萃取液(63 mM Tris-HCl pH7.6，20 mMMgCl₂，4 mMPMSF)，混成均質態。加入0.5 ml Laemmli protein solubilization buffer (186 mM Tris- HCl, pH 6.8; 6% SDS; 15% β- mercaptoethanol; 22.5% glycerol; Laemmli, 1970)，混合均勻。室溫下，以15,000 rpm 離心10 min (260D，Denville/USA)。取上清液，於100℃水浴 10 min後，移至4℃，10 min。室溫下，以15,133 rpm 離心10 min，收集上清液。再以12.5% 的SDS-PAGE 電泳進行蛋白的分離，並用Coomassie Brilliant Blue R-250 進行染色，染色及退染後之膠片以掃描機進行影像記錄。電白質電泳訊號圖以Quantity ONE® quantitation 軟體(Bio-Rad)分析計算各品系中穀蛋白、球蛋白及醇溶蛋白占總蛋白之比例，並利用自動化學分析儀(FOSS FIAstar-5000及SOFIA操作軟體系統，以凱氏氮分析法為基礎，以注入式自動抽取樣品及分析系統進行總蛋白質含量分析。