花蓮亞蔬五號番茄農桿菌基因轉殖系統之建立--材料與方法-4 - 農業知識入口網

材料與方法
七、南方式雜合檢測
取轉殖番茄之DNA 40μg，分別以三種限制酵素AvaI、NcoI、EcoRI酶切16小時後，分別注入1.1%（w/v）agarose之1 X TAE緩衝液膠體，電泳10伏特22-24小時，再將電泳膠片浸在0.25N HCl中20rpm震盪10分鐘，再浸於Denaturation 溶液（0.5M NaOH, 1.5M NaCl）中震盪15分鐘兩次，再浸於Neutralization溶液中（0.5M Tris-HCl, pH 7.5; 1.5M NaCl）震盪15分鐘兩次，最後用20X SSC溶液平衡10分鐘，便可進行轉漬。
轉漬時以帶正電的轉漬膜（Millipore IMMOBILON-NY+）壓在電泳膠片上，再依次以3M濾紙、衛生紙及重物壓在轉漬膜上以吸取20X SSC緩衝液，其間不定時更換衛生紙，經24-36小時後取出轉漬膜，轉漬膜表面用2X SSC緩衝液沖去多餘鹽類，自然乾燥後再經crosslink 120 mJ/cm2後便可進行南方雜合試驗。
雜合前先製作放射線探針，利用Random primer kit（Amershom Co. USA）使經定序確認之DNA探針與放射線dCTP³²相結合。將轉漬膜與預雜合緩衝液在42℃反應4小時，再使轉漬膜、雜合緩衝液與放射線探針在42℃中雜合隔夜，第二天取出轉漬膜於室溫下，以2X SSC緩衝液+0.1％SDS溶液60rpm震盪清洗10分鐘兩次，再置於50℃下0.1X SSC緩衝液+0.1％SDS溶液震盪清洗15分鐘一次，轉漬膜乾燥後，再用底片與轉漬膜進行感光壓片，置於-70℃二到四天後將底片沖洗顯像。本項工作在國立台灣大學植物科學研究所放射線實驗室中進行。